不同濃度的?全反式維甲酸對(duì)胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)影響
全反式維甲酸（All-trans-retinoic acid，ATRA）屬于類維甲酸家族成員，是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和胚胎發(fā)育中具有重要作用。ATRA被認(rèn)為是第一個(gè)腫瘤治療的靶向藥物，在臨床上主要用于治療急性早幼粒白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）。APL是急性髓系白血病的一種獨(dú)特亞型，表達(dá)早幼粒細(xì)胞白血病~維甲酸受體α（PML-RAR-α）癌蛋白，其特征在于纖溶酶產(chǎn)量增加導(dǎo)致嚴(yán)重出血。ATRA通過抑制纖溶酶的產(chǎn)生和降低膜聯(lián)蛋白A2和S100A100的表達(dá)在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及改善出血癥狀等方面發(fā)揮了重要作用。ATRA的臨床應(yīng)用將APL從一種高度致命的癌癥轉(zhuǎn)化為一種高度可治愈的疾病。
由于ATRA在APL中的臨床應(yīng)用取得了巨大的成功，ATRA在治療多種人類惡性腫瘤方面得到了廣泛的研究。然而，APL的遺傳和生理病理簡(jiǎn)單性在人類腫瘤中是相當(dāng)罕見的，APL因此是目前發(fā)現(xiàn)的唯一對(duì)ATRA作出有效反應(yīng)的惡性腫瘤。越來越多的研究表明，ATRA可以增強(qiáng)其它化療藥物的抗癌效應(yīng)：在體外，ATRA與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。ATRA與多西他奇（docetaxel）或泰索帝（taxotere）聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。有機(jī)砷化三聚氰胺（Organic arsenical melarsoprol）與ATRA聯(lián)合使用可明顯抑制人乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長(zhǎng)。ATO（arsenic trioxide）還可與ATRA協(xié)同抑制人肝癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。
受細(xì)胞系以及培養(yǎng)條件的影響，不同細(xì)胞對(duì)特定藥物的耐受性不同，在ATRA的使用中發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞的ATRA有效濃度不同：類維生素A 6-OH-11-O-羥基菲汀（6-OH-11-O-hydroxyphenantrene，IIF）是ATRA的合成衍生物。體外研究表明IIF可有效抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。40μmol/L和80μmol/L的IIF處理24h可顯著誘導(dǎo)SaOS-2細(xì)胞凋亡，但對(duì)U2OS細(xì)胞沒有明顯效應(yīng)。用5～50μmol/L的ATRA處理PANC-1細(xì)胞1-6 d，可呈劑量/時(shí)間依賴性抑制PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)。1～10μmol/L維甲酸衍生物在多種腫瘤細(xì)胞中具有顯著的抗腫瘤作用，也有文獻(xiàn)報(bào)道10倍低濃度（100～500nm的）ATRA可以抑制人髓母細(xì)胞（Medulloblastoma，MB）的增殖。但是，一些研究發(fā)現(xiàn)吸煙者如果攝入維甲酸會(huì)導(dǎo)致肺癌發(fā)病率增高，暗示維甲酸可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用。在五種鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinom，SCC）細(xì)胞中，20 nmol/L ATRA可導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)增加30%，而40～100 nmol/L ATRA則可將細(xì)胞增殖減少20～30%[10].
硼替佐米（Bortezomib，BTZ，商品名Velcade，PS-341）是用于治療多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）的臨床藥物。研究表明BTZ通過可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，從而抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)，進(jìn)而通過各種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，包括抑制核因子~Kβ的活性，激活p53，積累錯(cuò)折疊蛋白等。
不同濃度的ATRA是否會(huì)對(duì)胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響還未有研究，因此在本文中我們用濃度跨度較大的ATRA處理這兩種細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的ATRA對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同，低濃度的ATRA促進(jìn)PANC-1和U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度則抑制其生長(zhǎng)。我們還發(fā)現(xiàn)，BTZ可以通過凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞死亡，ATRA的促生長(zhǎng)或抑生長(zhǎng)的作用都可被BTZ調(diào)控，同時(shí)低濃度ATRA與BTZ聯(lián)合應(yīng)用會(huì)降低凋亡前蛋白Procaspase3的表達(dá)，表明聯(lián)合用藥可能影響細(xì)胞的凋亡途徑。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
ATRA濃度不同對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同
實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的ATRA（5、10、20、40、80、100、150、200μmol/L）分別處理PANC-1和U2OS細(xì)胞24h，采用MTS法檢測(cè)ATRA對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，ATRA對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)依據(jù)濃度的不同而有不同的效果。在PANC-1細(xì)胞中，低濃度（20，40，80，100μmol/L）的ATRA表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)的趨勢(shì)（P<0.001）。相反的，高濃度（200μmol/L）ATRA可明顯抑制PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。有趣的是，極低濃度的ATRA（5μmol/L）則表現(xiàn)出對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用（P<0.05），抑制率為89.50%±0.199（圖1A，表1）。在U2OS細(xì)胞中，我們也觀察到類似的現(xiàn)象。低濃度（10，20，40，80μmol/L）的ATRA可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是20，40μmol/L（P<0.01）。隨著濃度的升高，150，200μmol/L的ATRA表現(xiàn)出對(duì)U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著抑制作用（P<0.001）（圖1B，表1）。與PANC-1細(xì)胞不同的是，5μmol/L的ATRA并不能抑制U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)，這個(gè)獨(dú)特現(xiàn)象暗示PANC-1細(xì)胞中可能存在與U2OS細(xì)胞不同的ATRA應(yīng)答方式。
高濃度ATRA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力可被BTZ增強(qiáng)
為進(jìn)一步檢測(cè)BTZ對(duì)ATRA作用的影響，我們繼續(xù)進(jìn)行了高濃度ATRA聯(lián)合BTZ的用藥實(shí)驗(yàn)。采用200μmol/L ATRA和40 nmol/L BTZ單獨(dú)或聯(lián)合處理PANC-1或U2OS細(xì)胞24 h，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，高濃度的ATRA可以顯著抑制PANC-1和U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)（P<0.001），聯(lián)合應(yīng)用ATRA和BTZ可明顯抑制PANC-1和U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)（P<0.001）（圖2，表2），與單獨(dú)應(yīng)用ATRA相比，聯(lián)合用藥組都具有顯著差異（PANC-1,P<0.001;U2OS,P<0.01）；與單獨(dú)應(yīng)用BTZ相比，聯(lián)合用藥同樣具有顯著差異（P<0.01）（圖2）。
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