微生物生長曲線監測系統：12種LAB發酵物對霉菌生長的抑制作用
霉菌腐敗是乳制品行業的一個主要問題，導致大量食物浪費和巨大的經濟損失。乳制品為霉菌生長提供了有利的環境，由于產品表面的生長，可以發現明顯的變化。一些最常見的霉菌，例如青霉屬和毛霉屬，與乳制品腐敗有關。為了避免食品工業中的真菌腐敗，在產品制造過程中采取了很多措施來防止污染并抑制真菌生長?；瘜W防腐劑已在食品工業中使用，以保護食品免受不良生長，從而延長產品保質期，但公眾對化學防腐劑的廣泛使用越來越關注。此外，越來越多的霉菌不僅對抗生素產生抗藥性，而且對山梨酸和苯甲酸等食品防腐劑產生抗藥性。近年來，消費者對最低限度加工或不含防腐劑的食品的需求不斷增加，這導致人們對天然真菌控制替代品（例如抗真菌生物保護培養物）越來越感興趣。選定的乳酸菌（LAB）通常被報道為潛在的生物保存工具，可以抑制不同食品中的真菌生長，延長保質期，有時甚至改善營養價值和感官特性。LAB菌株對抗腐敗霉菌的活性機制被認為是多因素的，包括產生各種代謝物，包括揮發性化合物和非揮發性化合物。
本研究的目的是表征從新鮮發酵的乳制品（例如酸奶）中分離出的一組霉菌在三種溫度下的生長潛力。通過評估霉菌與有或沒有活細胞的LAB發酵物的直接相互作用效應，以及評估揮發物的作用的無直接接觸，來研究霉菌對不同LAB制劑的敏感性。評估選定組合中12種LAB培養物對這些霉菌生長的抑制作用。研究錳消耗導致的競爭排斥在抑制中的作用。
丹麥Biosense微生物生長曲線監測系統的應用
在25°C下監測霉菌細胞生長24小時。使用微生物生長曲線監測oCelloScope檢測系統（BioSense丹麥），這是一種新開發的光學檢測系統，基于結合光學技術的獨特光學掃描技術FluidScope TM。將每個霉菌的100微升MEB培養基中的孢子懸浮液（1.0×103孢子/mL）添加到96孔微孔板中（大約100個孢子/孔）。接種后將96孔微孔板在室溫下靜置約1小時，讓孢子在這些孔中沉降，然后放入oCelloScope系統中。自動測量樣品，并在24小時內每60分鐘記錄一次儀器得出的生長值。使用oCelloScope專用軟件UniExplorer(v.5.0.3)的背景校正吸收(BCA)算法{BCA=log10[Σ（校正吸收像素直方圖）]}進行自動生長動力學分析。對于每種霉菌菌株，通過三個技術重復進行生長測試。
實驗結論
乳制品非常容易受到腐敗霉菌的影響，因此表征霉菌的生長潛力至關重要。毛霉菌株在MEB培養基和酸奶中的生長速度都比青霉菌菌株快。除P.roqueforti ISI4外，所有測試的霉菌在MRS中生長時均受到12種LAB菌株的強烈抑制。從基于MRS的發酵液中去除LAB活細胞后，抑制效果下降，單獨揮發物的效果更小，表明預形成的化合物發揮了作用，但它們不是主要的抑制因素。當使用酸奶血清作為培養基時，觀察到乳酸菌生長減少和霉菌生長抑制較弱，而去除細胞導致活性幾乎完全喪失。在某些情況下，通過組合培養物可以增強抑制功效。在酸奶中，植物乳桿菌LP37造成的錳消耗在青霉菌和毛霉菌測試菌株的生長抑制中發揮著重要作用。因此除了未受影響的P.roqueforti ISI4之外，這些腐敗霉菌通常對能夠使基質中的錳無法利用的生物保護培養物敏感。
圖1、(A)oCelloScope監測的13種霉菌生長動力學分析。數據以三個重復的平均值表示。將MEB中每種孢子懸浮液100微升(1.0×103孢子/mL)加入96孔微孔板中，一式三次，25℃孵育24 h。4株毛霉的生長曲線為點線，9株青霉的生長曲線為實線。(B)在MEB培養基中生長的P.solitum ISI5(a)和M.circinelloides 01180023(B)的ocloscope圖像。比例尺:104μm。對13個霉菌在25°C下在MEB培養基中24小時的生長動力學分析（圖1A）表明，所有測試霉菌的初始接種量大致處于同一水平（100個孢子/孔），但觀察到較大差異在增長潛力方面。毛霉菌株通常比青霉菌菌株生長得更快，其中M.plumbeus 01180036是生長最快的分離株。M.circinelloides 01180023是第一個在大約10小時后達到穩定期的分離株，但達到的最高水平低于其他菌株。青霉屬菌株中生長最快的分離株是青霉ISI3，其生長速度幾乎與鉛青霉菌株一樣快。相比之下，P.roqueforti ISI4細胞相對于其他測試菌株表現出最慢的初始生長。
圖2、(A)用含有P.roqueforti ISI4的0.5%麥芽提取物軟瓊脂覆蓋的LAB培養物的抗真菌抑制評分示例。對照：沒有抗真菌培養物的MRS瓊脂，上面覆蓋有霉菌；“+++”：強抑制；“++”：弱抑制；“+”：生長但產孢延遲；“-”：無抑制。(B)板對板系統。L.parabuchneri LPB02（上板）產生的揮發性化合物對MEA板（下圖）上P.commune 01180002生長的抑制作用。在密閉室中，分別評估了P.commune 01180002在底部MEA板上的生長情況，頂部(b)上有L.parabuchneri LPB02板的MRS發酵物，頂部(a)上有對照板。
圖3、13種霉菌在酸奶瓊脂平板上的生長潛力，分別在5°C(A)、16°C(B)和25°C(C)下培養長達24天。通過將每個孢子懸浮液（20μL，1.0×10 5孢子/mL）點樣在酸奶瓊脂平板上一式三份來確定測試。條形代表三個重復的平均值的標準誤差。四種毛霉菌株用虛線標記；九個青霉菌菌株，帶有實線。虛線框中（B，C）的生長曲線被放大。
圖4、13個霉菌分別對12種含有活細胞的LAB發酵液(A)、LAB無細胞發酵液(B)以及MRS中LAB培養物的揮發物(C)的敏感性。LAB菌株代碼：LRH01、LRH05、LRH14、LRH16和LRH43為鼠李糖乳桿菌菌株，LP01、LP37和LP48植物乳桿菌菌株，LPC44和LPC46副干酪乳桿菌菌株，以及LPB02和LPB04 L.parabuchneri菌株。
圖5、酸奶中植物乳桿菌LP37造成的錳消耗。如所示添加不同濃度的錳（0.001、0.01和0.1 mM）。將帶有斑點青霉菌菌株和毛霉菌株（200個孢子/斑點）的平板在25°C下孵育5天。條形代表三個重復的平均值的標準誤差。Bio-LP37表示培養物植物乳桿菌LP37。閉合符號表示青霉菌菌株；空心符號表示毛霉菌株。
總結
由于食物浪費和經濟損失，乳制品的真菌腐敗是一個主要問題，一些真菌代謝物還可能對人類健康產生不利影響。乳酸菌(LAB)的使用正在成為化學防腐劑的潛在清潔標簽替代品。本研究的目標是表征從乳制品中分離出的一組霉菌（四種毛霉菌株和九種青霉菌菌株）在三種儲存溫度（5°C、16°C和25°C）下的生長潛力，然后研究這些霉菌對12種培養基的生長影響。使用Biosense微生物生長曲線監測系統在25°C下監測麥芽提取物肉湯中的真菌細胞生長和形態24小時。
使用oCelloScope檢測系統實時監測霉菌的生長曲線，oCelloScope檢測系統是一個基于自動光學檢測系統的小型便攜式平臺。該方法可用于在三維菌絲網絡形成之前早期檢測生長情況。還在不同溫度下孵育的酸奶瓊脂平板上進行了生長跟蹤，其中選擇5°C模擬冷藏溫度、16°C濫用冷鏈溫度和25°C室溫。oCelloScope測試和酸奶瓊脂斑點測試的結果非常一致。在測試的霉菌中，毛霉01180036是生長最快的，而青霉菌ISI4(P.roqueforti ISI4)是生長最慢的。在酸奶瓊脂平板上，所有霉菌都在5°C、16°C和25°C下以溫度依賴性方式生長，無論溫度如何，毛霉菌株都比青霉菌菌株生長得更快。使用高通量疊加方法測試了對12種LAB培養物的敏感性，其中除P.roqueforti ISI4之外的所有霉菌均受到強烈抑制。當在含有LAB菌株活細胞的瓊脂平板上發現霉菌孢子時，這些LAB的抗真菌作用得到了證實。與酸奶血清中的單一培養物相比，一些LAB二元組合提高了針對多種霉菌生長的抗真菌活性。對六種青霉菌和兩種毛霉菌株的可能抗真菌機制進行了檢查，因為錳耗盡導致的競爭排斥作用。本研究表明，除了未抑制的P.roqueforti ISI4之外，這種機制是測試霉菌的主要抑制因素，因為添加錳濃度增加至0.1 mM導致酸奶中霉菌生長部分或完全恢復。這些發現有助于了解影響乳制品霉菌腐敗的參數以及污染菌株、底物和生物保護性實驗室培養物之間的相互作用。
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