菌株雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性（二）
3.具有雙控制的生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)能夠獲得較高的生產(chǎn)產(chǎn)量
研究人員用編碼酵母中甘油合成途徑基因的pUC57-Gly質(zhì)粒轉(zhuǎn)化WT、SC和DC菌株，分別得到菌株WT-Gly、SC-Gly和DC-Gly。這些菌株按照先前的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。此外，我們?cè)谏L(zhǎng)培養(yǎng)基中加入卡芐西林，以確保質(zhì)粒的維持。去除IPTG后，SC和DC菌株生長(zhǎng)停滯，取常規(guī)樣品，測(cè)量甘油和葡萄糖濃度。
在WT-Gly菌株的情況下，葡萄糖在培養(yǎng)15小時(shí)后被完全消耗掉（圖3a）。在葡萄糖的指數(shù)增長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)菌產(chǎn)生甘油，甘油在葡萄糖耗盡后被同化。兩種生長(zhǎng)受阻的菌株消耗葡萄糖的速度較慢（圖3b，c）。培養(yǎng)24 h后，SC-Gly菌株消耗了開(kāi)始時(shí)供應(yīng)的大部分葡萄糖，DC-Gly菌株消耗了實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)供應(yīng)的所有葡萄糖。而且，這兩種菌株都不能同化所產(chǎn)生的甘油。
大腸桿菌中的天然甘油消耗途徑在葡萄糖存在下沒(méi)有活性，這是由于甘油激酶的碳分解代謝物阻遏。此外，pUC57‐Gly質(zhì)粒上攜帶的酵母甘油生產(chǎn)途徑是不可逆的。因此，葡萄糖耗盡后甘油的同化需要在大腸桿菌途徑中重新合成酶，由于RNA聚合酶表達(dá)抑制后轉(zhuǎn)錄活性的強(qiáng)烈降低，這在這個(gè)階段不再可能。相比之下，葡萄糖攝取和代謝所必需的酶在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)就已經(jīng)存在了。
WT-Gly菌株的甘油產(chǎn)量定義為在細(xì)胞攝取葡萄糖的時(shí)間間隔內(nèi)產(chǎn)生的甘油量除以消耗的葡萄糖量，為0.33ggly/gglc。為了計(jì)算SC-Gly和DC-Gly菌株的產(chǎn)量，在生長(zhǎng)停滯后測(cè)定葡萄糖消耗和甘油產(chǎn)量。與預(yù)期的一樣，生長(zhǎng)抑制細(xì)菌的甘油產(chǎn)量分別高于WT細(xì)菌，分別為0.55和0.41。
盡管SC和DC這兩種工程菌株之間有很小的差異，但一旦生長(zhǎng)被關(guān)閉，DC-Gly菌株與WT-Gly菌株相比，甘油產(chǎn)量有顯著改善。綜上所述，在外部表達(dá)控制下添加rpoA的遺傳冗余保留了資源從生長(zhǎng)重新分配甘油生物合成的可能性。
4.具有雙重控制的生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)在遺傳上是穩(wěn)定的
生長(zhǎng)停滯的菌株處于強(qiáng)大的選擇壓力下，任何恢復(fù)RNA聚合酶表達(dá)的突變體，即使是低水平的，也能夠生長(zhǎng)并最終接管種群。先驗(yàn)地，有兩種方式可能損害生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)的功能，并且細(xì)菌可以逃脫生長(zhǎng)控制。首先，lacI序列的突變可能導(dǎo)致無(wú)功能的轉(zhuǎn)錄阻遏物。第二，T5啟動(dòng)子區(qū)的突變可能使LacI與T5啟動(dòng)子的結(jié)合效率降低。最初的SC設(shè)計(jì)中，通過(guò)在染色體中插入兩個(gè)額外的lacI拷貝，可以大大降低第一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)，而通過(guò)將單一控制進(jìn)化為DC設(shè)計(jì)，可以解決第二個(gè)風(fēng)險(xiǎn)。在DC菌株的情況下，當(dāng)細(xì)菌突變?nèi)齻€(gè)(天然和額外的)lacI拷貝或rpoA和rpoBC上游的兩個(gè)lac操縱子序列時(shí)，才可以發(fā)生逃逸。
研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試了DC菌株的遺傳穩(wěn)定性是否確實(shí)比SC菌株有所改善。對(duì)于這兩種生長(zhǎng)控制菌株，從分離的克隆中隆中進(jìn)行了40次重復(fù)培養(yǎng)：在IPTG存在的情況下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后將預(yù)培養(yǎng)物洗滌并再稀釋到不含IPTG的培養(yǎng)基中。使用豐富的（LB）培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以獲得大的種群，從而增加突變的可能性。讓培養(yǎng)物進(jìn)化，并在24小時(shí)和96小時(shí)后計(jì)算逃逸種群的數(shù)量。逃逸種群能夠在生長(zhǎng)停滯的條件下生長(zhǎng)，即在沒(méi)有IPTG的情況下生長(zhǎng)。
圖4生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)設(shè)計(jì)的遺傳穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)(a)SC株和(b)DC株進(jìn)行40次重復(fù)培養(yǎng)，評(píng)估其遺傳穩(wěn)定性。對(duì)于每種培養(yǎng)物，測(cè)量了不同時(shí)間、24h（藍(lán)色）和96h（紅色）的光密度，并與WT對(duì)照的光密度進(jìn)行比較
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。雖然在24 h后SC菌株沒(méi)有檢測(cè)到逃逸現(xiàn)象，但是超過(guò)80%的培養(yǎng)物達(dá)到了與培養(yǎng)96 h后WT菌株觀察到的高光密度（圖4a）。對(duì)一些但不是所有的這些逃逸子的測(cè)序顯示了rpoBC啟動(dòng)子區(qū)域的關(guān)鍵突變。特別是，在LacI與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的一些lacO序列中發(fā)現(xiàn)了核苷酸替換。之前有報(bào)道稱，這些替換導(dǎo)致LacI的結(jié)合親和力更低，在原始序列親和力的<1%到2%之間。由于這些突變，即使在沒(méi)有IPTG的情況下，rpoBC操縱子也可以表達(dá)。相反，無(wú)論是在24h后還是在96 h后，DC應(yīng)變都沒(méi)有發(fā)生逃逸現(xiàn)象事件（圖4b）。這表明，與原有生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)的單對(duì)照設(shè)計(jì)相比，改進(jìn)后的雙對(duì)照設(shè)計(jì)的遺傳穩(wěn)定性有了很大的提高
5.雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)穩(wěn)定性的提高并不會(huì)降低其生存能力
DC菌株的遺傳穩(wěn)定性是通過(guò)進(jìn)一步修改細(xì)菌的必要轉(zhuǎn)錄機(jī)制獲得的。這些額外的修飾可能會(huì)影響細(xì)胞的活力，即一旦誘導(dǎo)劑在一段時(shí)間的生長(zhǎng)停滯后被重新供應(yīng)，它們就具能重新開(kāi)始生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段之間進(jìn)行迭代的可能性在生物技術(shù)過(guò)程中是很重要的。因此，研究人員對(duì)SC和DC菌株進(jìn)行了活性試驗(yàn)，并比較了結(jié)果。
通過(guò)經(jīng)典的擴(kuò)散平板法評(píng)估了生長(zhǎng)受阻細(xì)菌的生存能力。在24小時(shí)后，取SC和DC群體的常規(guī)樣本，在相同的IPTG培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)后，再稀釋到含葡萄糖和不含IPTG的M9培養(yǎng)基中。樣品被稀釋到已知的生物量，并分散在含有IPTG的固體瓊脂平板表面。對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)將每生物量CFU與在相同培養(yǎng)基中使用IPTG的同一菌株的每生物量CFU歸一化來(lái)量化其活力。
圖5具有單控制（SC）或雙控制（DC）生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)的菌株的生存能力。活力表示為SC菌株(橙色)和DC菌株(藍(lán)色)的每克生物量CFU與在相同條件下使用IPTG生長(zhǎng)的同一菌株的每克生物量CFU的歸一化
從圖5中可以看出，SC和DC菌株的生存能力評(píng)分沒(méi)有顯著性差異。對(duì)于兩株菌株，在沒(méi)有IPTG的情況下，活力呈指數(shù)下降，15 h后穩(wěn)定在0.01左右。這意味著，與在IPTG存在下生長(zhǎng)的相同菌株相比，只有1%的細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)停滯后能夠恢復(fù)生長(zhǎng)。相反，在相同的IPTG條件下培養(yǎng)的SC和DC菌株恢復(fù)生長(zhǎng)的能力并沒(méi)有隨著時(shí)間的推移而下降。
討論：
生物具有通過(guò)突變和適應(yīng)約束而進(jìn)化的能力。對(duì)于世代時(shí)間短、種群規(guī)模大的細(xì)菌來(lái)說(shuō)尤其如此，這使得它們能夠快速進(jìn)化。雖然這一特性在自然界中是相關(guān)的，但當(dāng)涉及到用于生物技術(shù)應(yīng)用的修飾細(xì)菌菌株時(shí)，它提出了一個(gè)挑戰(zhàn)。由于微生物本身就不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)意想不到的行為，因此可能導(dǎo)致工程遺傳功能的喪失。有害突變的發(fā)生對(duì)于控制細(xì)菌生長(zhǎng)的合成回路尤為重要，因?yàn)槭タ刂瓶赡軙?huì)在生長(zhǎng)受阻的種群中帶來(lái)明顯的適應(yīng)度優(yōu)勢(shì)。
為此，研究人員基于之前的生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)，添加了RNA聚合酶的另一個(gè)亞單位α被置于用于控制ββ’亞單位表達(dá)的同一lac系統(tǒng)的控制之下，從而顯著增加了生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性。
在生長(zhǎng)和生長(zhǎng)停滯之間轉(zhuǎn)換的可能性提高了持續(xù)代謝物生產(chǎn)的前景，包括生物量產(chǎn)生之后、生長(zhǎng)停滯和代謝物生產(chǎn)的周期。當(dāng)生物過(guò)程在惡劣條件下進(jìn)行時(shí)，所提出的方法特別有益，因?yàn)镽NA聚合酶調(diào)節(jié)可以提高細(xì)胞對(duì)酸性、高溫和高鹽濃度的耐受性。然而，為了使生長(zhǎng)和生長(zhǎng)停滯的重復(fù)循環(huán)實(shí)際可行，需要用其他方法取代IPTG的化學(xué)誘導(dǎo)，例如光遺傳學(xué)。此外，還可以控制生物合成途徑的表達(dá)，以強(qiáng)調(diào)生長(zhǎng)和生物合成之間的解離。這可以通過(guò)一個(gè)正交的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如T7RNA聚合酶，這將允許細(xì)胞繼續(xù)合成生物合成所需的酶，即使生長(zhǎng)受到抑制。此外，使用最優(yōu)和反饋控制方法與光遺傳誘導(dǎo)相結(jié)合，可以精確確定生長(zhǎng)和生長(zhǎng)停滯階段的持續(xù)時(shí)間，從而獲得產(chǎn)量和生產(chǎn)力之間的預(yù)期權(quán)衡。通過(guò)對(duì)RNA聚合酶的冗余控制而獲得的生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)的穩(wěn)定性增加，是通過(guò)這些擴(kuò)展實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物生產(chǎn)的連續(xù)、動(dòng)態(tài)控制的必要前提。
菌株雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性（一）
菌株雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性（二）
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