實時監測藍藻細胞內用于外源生物合成的苯丙氨酸相對含量的方法
苯丙氨酸作為8種必需氨基酸之一直接參與了生命活動體現者蛋白質的翻譯過程，對于生命活動的正常進行發揮著多方面的功能。其在體內的合成由莽草酸循環與芳香族氨基酸合成兩部分組成，而每部分均包含了多個反應步驟。苯丙氨酸在體內經苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經遞質和激素，被證實在抗抑郁等醫學癥狀方面有很好的效果。另外，苯丙氨酸也為苯丙酮酸(Liu et al.，2015)和其他芳香族化合物的合成，以及多種植物次生代謝生物活性物質，如黃酮類化合物合成提供底物(Dempo et al.，2014)(圖1)。因此，苯丙氨酸在醫藥及保健產品開發中具有重要的地位，但目前研究表明，苯丙氨酸僅可以在植物和一些微生物體內合成，而不能在哺乳動物細胞中發生。同時苯丙氨酸在植物中的含量較低，其合成途徑往往伴隨著強烈的產物反饋抑制，因此近年來利用微生物細胞工廠合成氨基酸(Brey et al.，2020)成為了一種重要的替代方法。
在早期的研究中，更多的利用大腸桿菌和酵母作為氨基酸類化合物異源生物合成的先驅平臺，并取得了系列的成果(Brey et al.，2020)。但氨基酸作為生命體的體現形式和初級代謝的重要底物，在細胞中并沒有過多的游離形式可用于生物工程當中的異源產物合成。因此，生物工程研究人員往往通過基因工程改造以及不定向化學誘變等方法期望得到可以進行高產苯丙氨酸合成的菌株。隨著全球氣候惡化等問題目益突出，碳中性的光合生物合成底盤藍藻受到了更多的關注。藍藻作為合成底盤可以通過直接吸收空氣中的二氧化碳，產生附加值較高的生物活性物質，且不與農業搶耕地便于集約系統化培養，因此很快發展成為了一種新的綠色“生物智造”平臺，得到了極大的關注與發展(Jin et al.，2021)。
苯丙氨酸及其所衍生的大多數化合物往往結構復雜且分子量較大，產物通常無法自由透過細胞的膜壁結構分泌到細胞外或透膜能力較低，因此產物的提取需對細胞進行破壁。而藍藻由于其細胞壁結構的特殊性，生物酶解以及超聲破碎往往難以達到理想的效果，因此藍藻中苯丙類化合物的提取往往包含了費時費工的細胞離心收集、高強度機械破壁、產物抽提以及利用高效液相色譜進一步進行儀器檢測，該傳統方法無法進行實時監測。如何在實際工作中對利用基因工程改造或化學誘變的細胞中苯丙氨酸相對含量進行快速界定便成為了擺在研究人員面前的首要問題。
本發明提供了一種利用密碼子簡并性實時檢測藍藻細胞內用于外源生物合成的苯丙氨酸相對含量的方法，包括以下步驟：
分別構建含編碼苯丙氨酸的極端偏好密碼子和極端稀有密碼子的氯霉素基因的重組載體，分別轉入藍藻中，得到含極端偏好密碼子的藍藻工程菌株和含極端稀有密碼子的藍藻工程菌株；
將構建的含極端稀有密碼子的氯霉素基因的重組載體轉入待檢測的藍藻菌株中，得到改造后的待測藍藻菌株；
將所述改造后的待測藍藻菌株和極端偏好密碼子的藍藻工程菌株、含極端稀有密碼子的藍藻工程菌株分別在含氯霉素、色氨酸和酪氨酸的液體培養基中培養，比較三種菌株的生長曲線，當改造后的待測藍藻菌株的生長曲線比含極端稀有密碼子的藍藻工程菌株的生長曲線有顯著性提高時，則說明所述待檢測的藍藻菌株細胞內用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有優勢。
優選的，構建含編碼苯丙氨酸的極端偏好密碼子或極端稀有密碼子的氯霉素基因的重組載體的方法，包括以下步驟：
將藍藻氯霉素基因中編碼苯丙氨酸的密碼子全部替換為TTT偏好密碼子，人工合成含強啟動子序列、核糖體結合位點、極端偏好密碼子的氯霉素基因和基因翻譯終止子序列的融合基因片段，或者將藍藻氯霉素基因中編碼苯丙氨酸的密碼子全部替換為TTC稀有密碼子，人工合成含強啟動子序列、核糖體結合位點、極端稀有密碼子的氯霉素基因和基因翻譯終止子序列的融合基因片段；
將合成的融合基因片段克隆至骨架載體中，得到重組載體；
將所述重組載體轉化至藍藻宿主中，得到含極端偏好密碼子的藍藻工程菌株或含極端稀有密碼子的藍藻工程菌株。
在本發明中，所述生長曲線的比較時間優選為培養120～160h，更優選為144h。當所述改造后的待測藍藻菌株的生長曲線越接近于極端偏好密碼子的藍藻工程菌株，遠離含極端稀有密碼子的藍藻工程菌株，說明待檢測藍藻菌株細胞內用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有更好的優勢。本發明對所述待檢測的藍藻菌株的來源沒有特殊限制，可如本發明中通過添加外源氨基酸的方式，或者采用本領域所熟知的物理化學方法誘導獲得的潛在高產苯丙氨酸菌株以及基因工程改造的高產苯丙氨酸的藍藻菌株均可。