10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發酵、產量的影響（二）
2、結果與分析
2.1不同有機物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM生長的影響
本研究通過改變培養基中添加有機物的濃度，探究不同有機物的不同濃度對A.ferrooxidans BYM生長的影響。
2.1.1亞鐵氧化速率的比較
圖1不同濃度不同小分子有機酸對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01
在探究不同有機物的不同濃度對A.ferrooxidans BYM生長的影響試驗中，l-抗壞血酸、蘋果酸以及葡萄糖酸的添加可促進A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化。如圖1所示，隨著l-抗壞血酸(圖1A)和蘋果酸(圖1B)濃度的增加，A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率總體呈現逐漸降低的趨勢，2 mmol/L l-抗壞血酸添加組與5 mmol/L蘋果酸添加組的亞鐵氧化速率顯著高于未添加有機物組，表明2 mmol/L l-抗壞血酸與5 mmol/L蘋果酸對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率具有促進作用。隨著葡萄糖酸(圖1C)濃度的增加，其亞鐵氧化速率呈現先上升后下降的趨勢。5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖酸添加組的亞鐵氧化速率均顯著高于未添加有機物組，表明5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖酸對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率具有促進作用。其中，2、8、10 mmol/L的l-抗壞血酸添加組相較于未添加有機物組存在極顯著差異(P<0.01)，5、10、20、30 mmol/L的蘋果酸添加組相較于未添加有機物組存在極顯著差異(P<0.01)，5、20、30、40 mmol/L的葡萄糖酸添加組相較于未添加有機物組存在極顯著差異(P<0.01)。
圖2不同濃度不同有機物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率影響A：檸檬酸.B：酒石酸.C：TritonX-100.D：吐溫-80.E：SDS.F：甘氨酸.G：EDTA-2Na.**表示P<0.01
如圖2所示，添加不同濃度檸檬酸、酒石酸、TritonX-100、吐溫-80和SDS，隨著有機物濃度的增加，A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率均整體呈現下降趨勢。檸檬酸添加組(圖2A)、酒石酸添加組(圖2B)、TritonX-100添加組(圖2C)和SDS添加組(圖2E)相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)。0.5、4、8 mmol/L吐溫-80添加組(圖2D)相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)。說明檸檬酸、酒石酸、TritonX-100、吐溫-80和SDS的存在均會影響A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率，抑制菌體的生長。
如圖2所示，根據甘氨酸和EDTA-2Na試驗可知，隨著甘氨酸濃度的增加，其亞鐵氧化速率呈現先上升后下降的趨勢(圖2F)。增加EDTA-2Na濃度，其亞鐵氧化速率呈現先降低然后趨于平穩的趨勢(圖2G)。甘氨酸添加組與EDTA-2Na添加組相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)。由此可說明，上述有機物的添加均會抑制A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化能力。
綜上所述，l-抗壞血酸濃度為2 mmol/L、蘋果酸濃度為5 mmol/L、葡萄糖酸為5 mmol/L和20 mmol/L時均會促進A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化速率，分別可達到1.55×10?6、1.70×10?6、1.42×10?6和1.47×10?6 mol/h。然而，其他有機物的添加均對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化產生抑制作用。因此，選擇l-抗壞血酸、蘋果酸和葡萄糖酸進行下一步試驗。
為進一步篩選磁小體合成最優促進劑，選用l-抗壞血酸(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)、蘋果酸(0、0.5、1.0、3.0、5.0 mmol/L)和葡萄糖酸(0、5、10、15、20 mmol/L)進行試驗，以A.ferrooxidans BYM達到對數期的亞鐵氧化速率、菌體濕重和磁小體產量作為篩選標準(圖3)。
圖3不同有機酸對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01
如圖3所示，1.0 mmol/L l-抗壞血酸對A.ferrooxidans BYM菌體生長的促進作用最顯著(圖3A)，其亞鐵氧化速率可達2.17×10?6 mol/h。1.0 mmol/L的蘋果酸對A.ferrooxidans BYM菌體生長的促進作用最明顯，其亞鐵氧化速率高于l-抗壞血酸，可達2.40×10?6 mol/h(圖3B)。葡萄糖酸濃度為20 mmol/L時，對A.ferrooxidans BYM菌體生長的促進作用最明顯，其亞鐵氧化速率最高，可達2.42×10?6 mol/h(圖3C)。0.5、1.0、1.5 mmol/L l-抗壞血酸添加組相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘋果酸添加組相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)，10、15、20 mmol/L葡萄糖酸添加組相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)。
2.1.2菌體生長的比較
如圖4所示，l-抗壞血酸以1.5 mmol/L添加時，其菌體濃度高于未添加組，可達0.160 g/L(圖4A)，相較于未添加組存在極顯著差異(P<0.01)。
其中，0.5 mmol/L l-抗壞血酸試驗組菌體濕重較低，相較于未添加組存在極顯著差異(P<0.01)。蘋果酸濃度在1 mmol/L時，其菌體濃度略高于未添加有機物組，此時菌體濃度最高，可達0.145 g/L(圖4B)。其中，3 mmol/L和5 mmol/L蘋果酸試驗組相較于未添加有機物組存在極顯著差異(P<0.01)。當葡萄糖酸添加量為15 mmol/L，其菌體濃度最高，可達0.188 g/L(圖4C)。其中，添加10 mmol/L葡萄糖酸試驗組相較于未添加有機物組存在顯著差異(P<0.05)，添加15 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖酸試驗組相較于未添加有機物組存在極顯著差異(P<0.01)。
圖4不同濃度有機物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM菌體濃度的影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01，*表示P<0.05
2.2不同有機物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM磁小體合成的影響
如圖5所示，磁小體提取試驗表明，1.0、1.5、2.0 mmol/L l-抗壞血酸添加組磁小體產量均高于未添加有機物組。1.5 mmol/L l-抗壞血酸添加組磁小體產量最高，為9.83×10?4 g/L(圖5A)。1.0、1.5、2.0 mmol/L l-抗壞血酸添加組相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)。1.0 mmol/L蘋果酸添加組磁小體產量最高為7.58×10?4 g/L(圖5B)。0.5、1.0、3.0 mmol/L蘋果酸添加組相較于未添加有機物組均存在極顯著差異(P<0.01)。10 mmol/L葡萄糖酸添加組磁小體產量最高，為2.00×10?3 g/L(圖5C)。5、10、15 mmol/L葡萄糖酸添加組磁小體產量與未添加有機物組相比均存在極顯著差異(P<0.01)。同時，所有蘋果酸以及葡萄糖酸添加組的磁小體產量均高于未添加組。
圖5不同濃度有機物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM磁小體合成的影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01
2.3葡萄糖酸對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM生長及磁小體合成的促進作用
根據上述試驗結果選擇10 mmol/L的葡萄糖酸進行A.ferrooxidans BYM發酵培養，以不添加有機物的A.ferrooxidans BYM作為對照組。葡萄糖酸作用前后菌體表觀形態以及表面基團化結果如圖6所示。SEM結果表明，添加葡萄糖酸組細菌呈橢圓形，表面光滑(圖6A)。而對照組表面有褶皺，呈桿狀(圖6B)。TEM結果表明，添加葡萄糖酸組細菌胞內磁小體分散排列(圖6C)，數量明顯高于未添加葡萄糖酸組(圖6D)。
采用FTIR儀對添加10 mmol/L葡萄糖酸A.ferrooxidans BYM進行測試，如圖7所示。以處于對數期的A.ferrooxidans BYM作為對照。
添加10 mmol/L葡萄糖酸組在3 402.02、2 926.84、1 652.82、1 536.74、1 236.29、1 079.29和614.31 cm?1處出現峰值。未添加有機物組在3 414.28、2 926.87、2 362.35、1 651.55、1 538.74、1 453.26、1 236.65、1 080.13和612.30 cm?1處出現峰值(圖7)。通過與NIST數據庫比較可知，經過葡萄糖酸處理后相較于未添加葡萄糖酸組在2 362 cm?1處少了一個峰，推測可能是C10H?。
圖6 Acidithiobacillus ferrooxidans BYM的掃描電鏡圖及透射電鏡圖A：500 nm標尺下的葡萄糖酸處理組掃描電鏡圖.B：500 nm標尺下的對照組掃描電鏡圖.C：500 nm標尺下的葡萄糖酸處理組透射電鏡圖.D：500 nm標尺下的對照組透射電鏡圖.箭頭指向磁小體黑色顆粒
為探究A.ferrooxidans BYM發酵過程中菌體變化、磁小體生成以及亞鐵消耗情況，選用菌體生長動力學模型建立最常用的是Logistic模型和Monod方程。Logistic模型是一個非常典型的S型曲線方程，常被用來描述菌體濃度與營養物質之間的非線性關系。因此A.ferrooxidans BYM菌體生長動力學模型選用Logistic方程進行擬合。利用1stOpt軟件對試驗數據進行非線性擬合，可得動力學參數為X0=0.010 5，Xm=0.165 2，μm=0.084 3。代入公式(2)，整理可得A.ferrooxidansBYM菌體生長隨時間變化的動力學方程，見公式(5)。
式中，X代表生物量(g/L)，t代表發酵時間(h)。
由公式(5)所述動力學方程可知，隨著發酵時間的延長，菌體濕重逐漸增加，將擬合得到的參數代入方程，得到R2為0.99，擬合結果良好，說明該模型能夠很好地描述A.ferrooxidans BYM菌體生長過程。
圖7葡萄糖酸處理前后Acidithiobacillus ferrooxidans BYM的傅里葉變換紅外光譜圖
A.ferrooxidans BYM磁小體生成動力學為磁小體生物合成過程，選用Luedeking-Priet方程構建動力學模型，此方程能夠準確描述出產物形成同菌體生長的相關性。利用1stOpt軟件對不同發酵時間磁小體濃度進行非線性擬合，得到動力學參數為P0=0.000 1，α=0.000 9，β=0.000 2，代入公式(3)，整理可得A.ferrooxidans BYM磁小體合成隨時間變化的動力學方程，見公式(6)。
式中，P代表磁小體生成量(g/L)，t代表發酵時間(h)。
由公式(6)所述的動力學方程可知，隨著發酵時間的延長，磁小體的產量逐漸增加，將擬合得到的參數代入方程，得到R2為0.98，擬合結果良好，說明該模型能夠很好地描述A.ferrooxidans BYM磁小體生成過程。
A.ferrooxidans BYM是以鐵或硫為底物進行電子傳遞的微生物，并且僅在亞鐵存在的情況下，A.ferrooxidans BYM才能合成磁小體。因此，本研究將FeSO4作為關鍵底物進行動力學分析。利用1stOpt軟件對不同發酵時間的亞鐵濃度進行非線性擬合，得到A.ferrooxidans BYM亞鐵消耗動力學參數為S0=?0.995 3，a=0.029 0，b=0.000 3，代入公式(4)，整理可得A.ferrooxidans
式中，S代表亞鐵濃度(g/L)，t代表發酵時間(h)。
由公式(7)所述的動力學方程可知，隨著發酵時間逐漸接近72 h，亞鐵含量趨近于0，R2為0.98，擬合結果良好，說明該模型能夠很好地描述A.ferrooxidans BYM亞鐵利用過程。
10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發酵、產量的影響（一）
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