丙酸銨&中鏈脂肪酸可抑制飼料腐敗真菌謝瓦列曲霉生長
研究背景：在飼料中添加防腐劑丙酸銨和中鏈脂肪酸（MCFA）對耐干燥真菌謝瓦列曲霉（Aspergillus chevalieri）的協同抗真菌效果。謝瓦列曲霉是一種常見的飼料腐敗真菌，能在低水分活性條件下生長，導致飼料營養價值下降，并可能產生有害的次級代謝產物，如霉菌毒素，影響動物健康和產品安全。丙酸作為一種廣泛使用的有機酸防腐劑，在低水分環境中能有效抑制多種腐敗細菌、酵母和絲狀真菌的生長，包括產毒的曲霉菌。然而工業應用中為了安全和便利，常將丙酸與氨水合用形成丙酸銨，這一過程雖然減輕了丙酸的刺激性，但也降低了其抗真菌效力。為彌補這一不足，研究者探索了添加MCFA以增強丙酸銨的抗真菌效果。MCFA是一系列飽和的脂肪酸，包括辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）和月桂酸（C12:0），它們因其親脂性質而具有抗菌性，可能通過影響細胞膜或干擾能量產生過程中的膜定位過程來發揮作用。本研究中，通過實驗方法研究者評估了丙酸銨和MCFA單獨以及組合使用對謝瓦列曲霉休眠和發芽分生孢子、芽管和菌絲的影響。研究發現丙酸銨和MCFA的組合處理對謝瓦列曲霉的休眠分生孢子具有顯著的協同抗真菌效果，幾乎完全抑制了菌落的形成。此外該組合處理還顯著降低了發芽率，并在對菌絲的短暫處理中增加了細胞死亡。顯微鏡觀察顯示，組合處理導致細胞結構出現扭曲和損傷，包括線粒體形態的異常變化，表明可能發生了自噬。本研究的發現對于提高飼料和食品儲存的安全性和穩定性具有重要意義，為開發新的或改進現有的抗真菌劑提供了科學依據。通過使用丙酸銨和MCFA的組合，可能更有效地控制飼料中的真菌生長，減少經濟損失，并提高動物產品的質量。
丹麥Biosense微生物生長動態監測系統的應用
oCelloScope微生物動態監測系統被用來監測和量化謝瓦列曲霉分生孢子的腫脹和隨后的發芽過程。同時也可實時捕捉到分生孢子在不同處理條件下的變化，包括細胞的膨脹和發芽管的形成。該設備能獲取96孔平底微量滴定板中沉降細胞的，使研究人員能夠在一項實驗中監測多種處理對分生孢子腫脹和芽管形成的影響。將分生孢子以105個分生孢子/ml的密度懸浮在麥芽提取物培養基中，并且對所有處理進行六倍測試。對于每次測量，每孔使用100μl的104個分生孢子，并且作為對照，監測對照麥芽提取物培養基中的分生孢子。用于采集圖像、對象跟蹤（包括分割）、對象計數和生長動力學分析。對于采集，選擇24次重復，每孔2小時時間間隔，每個時間點從每個孔的中心拍攝10個圖像。對于分割使用fungHmin算法（對比度=0.40，閾值=25.00），對于生長動力學分析，使用SESAfungiNormalized算法，用于計算增長率（特定增長率）的最大斜率。
實驗結論
研究發現丙酸銨和中鏈脂肪酸（MCFA）的組合對謝瓦列曲霉（Aspergillus chevalieri）的休眠分生孢子、發芽分生孢子、芽管和菌絲具有顯著的協同抗真菌效果。這種協同作用在低濃度下就能顯著提高抗真菌活性。通過透射電子顯微鏡觀察，丙酸銨和MCFA的組合處理導致真菌細胞結構出現扭曲和損傷，包括線粒體形態的異常變化，這表明可能發生了細胞自噬。使用oCelloScope微生物動態監測系統獲得的生長曲線顯示，丙酸銨和MCFA的組合處理延遲了真菌細胞的生長速率，并降低了其最大特定生長率。丙酸銨和MCFA的組合處理顯著降低了真菌細胞的活性，增加了細胞損傷和死亡率。丙酸銨和MCFA的組合可能在飼料和食品儲存領域具有重要的應用潛力，有助于減少真菌污染和延長產品貨架期。
圖1、不同處理方法對雪蓮分生孢子的影響。分生孢子大小約為5μm。
圖2、發芽的雪蓮分生孢子的。在經過或未經處理的麥芽提取物培養基中孵育21小時后。a.)在對照培養基中可以看到許多芽管的發育。b.)PA1處理后可見一些芽管和腫脹的分生孢子。c.)經過M1處理的胚管d.)PAM1中的一些腫脹孢子。
圖3、使用oCelloScope與各種成分一起孵育的單個分生孢子的延時。之間的時間間隔為2小時。
圖4、與各種成分一起孵育的細胞的生長曲線。使用ocelloScope微生物動態監測系統的SESA NORMALIZED算法根據細胞邊界內占據的總面積的增加并在6個孔中獲得的生長進行計算。
圖5、萌發分生孢子的比生長率。根據oCellscope軟件的歸一化SESA算法獲得的數據計算得出的。R腳本使用各個孔中顯示的生長曲線的4個連續點（log(1+x)值）。最大斜率被解釋為特定增長率的指示。通過方差分析對這些值進行統計測試，然后進行事后Tukey檢驗。
總結
本研究旨在探究中鏈脂肪酸（MCFA）對丙酸銨配方的增強效果，評估其對飼料腐敗真菌謝瓦列曲霉的休眠和發芽分生孢子、芽管和菌絲的抗真菌作用。通過實驗室測試，使用不同濃度的丙酸銨和MCFA單獨或組合處理，對謝瓦列曲霉的不同發育階段進行了抗真菌效果評估。實驗包括了對休眠分生孢子、發芽分生孢子、芽管和菌絲的觀察和分析。研究發現丙酸銨和MCFA組合處理對休眠分生孢子具有顯著的抗真菌效果，幾乎完全抑制了菌落的形成。發芽率在16 mM丙酸銨和0.26 mM MCFA存在時顯著降低，而單獨使用MCFA時對發芽影響不顯著。對菌絲的短暫處理顯示，組合處理相比單獨成分顯著增加了細胞死亡。顯微鏡觀察揭示了丙酸銨和MCFA組合處理導致細胞結構扭曲，包括線粒體形態異常，暗示了細胞自噬的發生。丙酸銨和MCFA的組合對謝瓦列曲霉的真菌生存結構在發芽和生長細胞的短暫處理期間具有協同抗真菌效果。這一發現對于飼料和食品儲存領域具有潛在的重要性，有助于提高產品的安全性和延長保質期。oCelloScope微生物動態監測系統的使用為本研究提供了一種高效、精確的方法來評估不同抗真菌劑對真菌生長和發育的影響，這對于開發新的食品和飼料保存策略具有重要意義。
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