?嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸鹽液體培養基中的生長情況與代謝產物（一）
嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被稱作新一代益生菌，是一種典型的哺乳動物腸道菌，依賴于腸道上皮細胞分泌的黏蛋白生存，是腸道黏液層的關鍵微生物，更與多種疾病存在重要關聯。Akk作為一種典型的腸道菌，只能耐受低濃度的氧氣，其體外培養更是生長周期長、生長速度慢。本團隊研究發現，Akk可利用硫乙醇酸鹽液體培養基，且該培養基成分簡單價格便宜，唯其生長速度較為緩慢。
東北農業大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室的武曉玲、徐珒昭、許曉曦*等人利用非靶向代謝組學技術對比分析Akk在硫乙醇酸鹽液體培養基和優化培養基中代謝產物的差異，結合京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路探究其特征性代謝產物與疾病的關聯，并以此證明優化培養基在工業化高密度培養中的優勢及應用前景，旨在為Akk在中國的工業化生產提供科學基礎。
1 Akk在兩種培養基中的生長情況對比
由于Akk在硫乙醇酸鹽液體培養基中生長其菌液密度極低（生長速度慢且活菌數較少），因此本課題組前期在硫乙醇酸鹽液體培養基的基礎上，對Akk培養基進行優化。為確定Akk在兩種培養基中的生長穩定期以制備發酵上清液樣本，并對比Akk在兩種培養基中的生長情況，通過測定菌液OD600 nm并繪制生長曲線，結果如圖1所示。
由圖1可知，0～8 h為Akk的生長遲緩期，12 h左右進入生長對數期。在硫乙醇酸鹽液體培養基中，Akk生長對數期為12～32 h，32 h菌液OD600 nm達到最高（0.269±0.003），之后進入穩定期，穩定期活菌數為6.75×107 CFU/mL。而在優化培養基中的生長對數期同樣在12 h左右進入對數期，44 h時菌液OD600 nm最高可達0.761±0.011，是硫乙醇酸鹽液體培養基的2.83倍，并在44 h之后趨于穩定，穩定期的活菌數為1.74×109 CFU/mL，比硫乙醇酸鹽液體培養基高出2個數量級。由此可知，優化后的培養基雖相對延長了Akk的對數生長期，但顯著提高了Akk的菌液密度及活菌數。并由此選擇其在硫乙醇酸鹽液體培養基和優化培養基中進入生長旺盛期的32 h和44 h發酵上清液，用以分析兩組樣本的差異代謝物。
2差異性代謝組學分析結果
2.1 QC分析
為評價儀器的穩定性及數據質量的可靠性，分別在正負離子模式下將QC樣本總離子流圖進行譜圖重疊比較，結果如圖2所示。結果表明兩種模式下各色譜峰的響應強度和保留時間均基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小，實驗結果較為可靠。
2.2代謝物鑒定數量及化學分類歸屬統計
通過高效液相色譜-串聯飛行時間質譜聯用儀檢測Akk在兩種培養基發酵上清液中的代謝產物，正負離子模式下合計鑒定到代謝產物2 253種，其中正離子模式下鑒定到代謝產物1 585種，負離子模式下鑒定到668種。根據化學分類歸屬信息將所有代謝物進行分類統計，各類代謝物數量所占比例如圖3所示。
兩組樣本中檢測到的代謝物包括有機酸及其衍生物（34.976%），脂質和脂質類分子（21.127%），有機雜環化合物（10.567%），苯甲酸類（6.569%），有機氧化合物（5.237%），苯丙烷和聚酮（4.172%），核苷、核苷酸和類似物（2.308%），有機氮化合物（1.243%），生物堿及其衍生物（0.666%），木質素、新木質素及相關化合物（0.178%），有機金屬化合物（0.133%），有機硫化合物（0.133%），烴類衍生物（0.089%）和未命名化合物（12.605%）等。
2.3組間差異分析
本研究結合單變量統計分析和多維統計分析方法，篩選Akk在兩種培養基中的顯著性差異代謝物，對正、負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物進行分析。
單變量統計分析
在進行兩組樣本間的差異分析時，常用的單變量統計分析方法包括差異倍數（FC）分析、T檢驗/非參檢驗。基于單變量分析，對正、負離子模式下檢測到的所有代謝物（含未被鑒定的代謝物）進行差異分析，篩選出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差異代謝物共902種，其中正離子模式下670種，負離子模式下232種。將這些差異代謝物用火山圖的形式表示，結果如圖4所示。
如圖4所示，每個圓圈代表一個特定的代謝產物，優化后相對優化前，紅色為顯著上調的代謝產物（FC＞1.5，P＜0.05），藍色為顯著下調的代謝產物（FC＜0.67，P＜0.05），圓圈越靠近左右兩邊和上邊，差異性越顯著，黑色為非顯著性差異代謝物。之后研究均針對紅色和藍色圓圈代表的顯著性差異代謝物。
多維統計分析
多維統計分析可以從總體水平反映組間差異以及組內的變異度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。將鑒定到的所有代謝物重新線性組合得到PCA模型，采用PCA方法，能從總體上反映樣本的總體分布趨勢和組件樣本的差異度。兩組樣本的PCA得分圖如圖5所示。
圖5中橢圓代表95%置信區間，同一顏色的點表示組內的各個生物學重復，由點的分布狀態可以看出，該模型可以區分兩組樣本，組間樣本的數據點很好地集中在一起。PCA模型參數R2X越接近1表明模型越可靠，正、負離子模式下的模型解釋率R2X分別為0.835和0.855。結果表明該模型穩定可靠，實驗重復性好，隨機誤差較小，可進一步對樣本進行差異性分析。
OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗如圖6所示，t能最大程度反映組間差異，而to則反映組內變異。可以看出OPLS-DA模型可顯著區分兩組樣本，且組內差異較小，結果與PCA模型一致。經7次循環交互驗證得到模型評價參數R2Y、Q2，通常情況下Q2＞0.5即表明模型穩定可靠。該模型正、負離子模式下的Q2分別為0.998、0.999，均大于0.5。在置換檢驗中，隨著置換保留度逐漸下降，隨機模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現象，模型穩定性良好。
篩選差異代謝物
OPLS-DA模型得到的變量權重值（VIP）表示變量投影重要度，值越大，表示越重要。本實驗以VIP＞1和P＜0.05為顯著性差異代謝物的篩選標準，正離子模式下篩選到670種顯著性差異代謝物，負離子模式下篩選到232種顯著性差異代謝物，由于篩選到的差異代謝物過多，且表格無法直觀地顯示這些代謝物的FC，因此，選擇VIP值前50的差異代謝物，以柱狀圖形式展示鑒定到的顯著性差異代謝物的FC變化，結果如圖7所示。可以看出，與硫乙醇酸鹽液體培養基相比，Akk在優化培養基中發酵后，正離子模式下22種代謝產物顯著上調，28種代謝產物顯著下調，負離子模式下顯著上調代謝產物22種，顯著下調代謝產物28種。后續將對這些顯著性差異代謝產物進行分析。
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