不同溫度和pH對白三葉草鏈格孢菌菌落生長的影響【實驗結果】
白三葉草（Trifolium repens Linn.），中文異名白車軸草、白花苜蓿、白花車軸草、荷蘭翹搖等，為豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生牧草。其營養價值好，柔嫩多汁，適口性好，產草量高，可作家畜、家禽的優質飼料和綠肥。同時因其生長力強，繁殖容易，綠色期長，耐踐踏，被廣泛應用于城市綠化建設，是優良的綠化觀賞草坪種。
鏈格孢菌屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬，全世界已經描述的約有500種，其中90%以上的種是兼性寄生于不同科的植物上，可引起多種葉斑病，常稱為黑斑病。周曉燕報道的白三葉草黑斑病的病原有兩種，一種為三葉草黑斑菌，屬子囊菌亞門、座囊菌目、座囊菌科、黑斑座囊菌屬，無性世代為三葉草黑斑集梗，屬半知菌亞門、叢梗孢目、集梗屈頂霉屬。另一種為三葉草多孢小球殼菌，屬子囊菌亞門、座囊菌目、座囊菌科、多孢小球殼菌屬。李晶等報道，鏈格孢菌為安徽銅陵銅尾礦區的優勢植物白車軸草葉斑病的主要致病菌。白三葉草鏈格孢菌主要危害葉片、葉柄，通常為小而密集的黑色或烏黑色病斑，近圓形或不規則形，環境干燥時葉片枯黃早衰，嚴重影響白三葉草的應用價值和觀賞性。筆者于2014年在甘肅農業職業技術學院植物保護實驗室研究了溫度和pH對白三葉草鏈格孢菌菌落生長的影響，以期為防治白三葉草鏈格孢菌提供參考。
1材料與方法
1.1供試材料
供試白三葉草葉片采自湖北省武漢市。PDA培養基配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL。主要儀器為超凈工作臺，恒溫培養箱，生物顯微鏡。
1.2病原菌的分離培養
選擇具有典型癥狀的白三葉草葉片，洗凈，晾干，取新鮮病斑病健交界部分，剪取邊長4～5 mm的病組織數塊，置于滅菌小容器內，用70%酒精漂洗2～3 s，然后用0.1%升汞溶液消毒1～2 min，再經無菌水漂洗3～4次，然后用滅菌的濾紙吸干水分。最后將病組織放到平板培養基上，25℃下進行培養，3 d后檢查分離、鏡檢、轉管、純化。
1.3柯赫氏法則印證
選取白三葉草健康的葉片，進行表面消毒，放在底層鋪有吸水紙的搪瓷盤中，將純化后的菌絲接種于PDA培養基上培養7 d（圖1）。在菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅接種在離體葉片上，以接種無菌的PDA培養基作為對照。25℃恒溫下保濕培養。觀察并記載發病情況，將發病葉片的病原菌再分離純化并進行鏡檢。
1.4不同溫度下菌絲生長觀察
設15、20、25、30、35、40℃6個溫度處理，每處理3個重復。在培養7 d的菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅，接種在不同處理培養基上，按設置溫度恒溫培養，7 d后觀察記載菌落生長情況。
1.5不同處理pH菌絲生長觀察
用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調PDA培養基的pH至5、6、7、8、9。每處理設3個重復。在培養7 d的菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅，接種在不同pH培養基上，25℃下恒溫培養，7 d后觀察記載菌落生長情況。
2結果與分析
2.1病原菌鑒定
如圖2所示，在PDA培養基上菌落圓形，中部黃褐色至黑色，邊緣為乳白色，短絨狀。從圖3看出，分生孢子梗褐色至暗褐色，分支或不分支，有隔。分生孢子棒狀或倒棒狀，暗褐色，0～3個縱隔，1～6個橫隔。根據病原菌的形態特征，鑒定該病原菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬真菌。
2.2溫度對菌落生長的影響
從表1可以看出，PDA培養基培養7 d，25℃處理下菌落生長最快，平均直徑為7.1 cm；其次是20℃處理，平均直徑為5.6 cm。35℃處理下菌落生長最慢，平均直徑為1.9 cm。40℃處理下平均直徑大于35℃處理的平均直徑，這可能跟實驗誤差有關。對菌落直徑進行方差分析的結果表明，不同的溫度條件對鏈格孢菌的生長有顯著影響，其中25℃條件下與其余溫度條件下各處理差異極顯著；溫度過低（15℃）或過高（35℃）時菌落生長無顯著性差異。
2.3 pH對菌落生長的影響
通過表2可以看出，隨pH增大，鏈格孢菌菌落直徑呈先增大后減小趨勢。當pH為6時，菌落生長速度最快，平均直徑為9.0 cm；pH為7時，平均直徑7.1 cm；當pH大于7時，菌落生長受到抑制；當pH為9時，菌落直徑最小，為2.7 cm。對不同pH下菌落直徑方差分析的結果表明，不同的pH對鏈格孢菌菌落的生長有顯著影響。pH為6時，與其余各pH下的處理差異達極顯著水平；pH為5和pH為8的處理之間差異不顯著，均與pH為9的處理差異極顯著。
表2不同pH對菌落直徑的影響
3小結
1）通過對白三葉草鏈格孢菌進行分離，純化培養，觀察其菌落形態、顏色、大小、生長速度，并在顯微鏡下觀察其分生孢子梗和分生孢子的形態特征，鑒定該病原菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬真菌。這與李晶等人報道的結果相吻合。
2）溫度、pH對菌落生長有一定的影響。在PDA培養基上，25℃處理下菌落生長最快，大于或小于25℃對菌落生長均有一定的抑制作用，故白三葉草鏈格孢菌生長的適溫為25℃。pH為6時，菌落生長速度最快，pH大于7或小于6對菌落生長均有一定的抑制作用，故白三葉草鏈格孢菌在弱酸性的環境下生長速度最快。
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