細菌懸液中活菌濃度的檢測方法：平板點樣技術VS傳統平板涂布法
[摘要]目的比較平板點樣法與傳統平板涂布計數法，建立更為簡便的細菌懸液中活菌濃度的檢測方法。方法將3株A群溶血性鏈球菌制備成多份菌懸液，稀釋成不同梯度，用調理吞噬實驗中的平板點樣技術和傳統平板涂布法同時檢測，比較兩種方法計數結果，分析相關性和顯著差異。結果不同菌株和稀釋方法中平板點樣法的結果均隨菌液稀釋梯度呈現出較好的梯度；兩種方法計數結果呈高度相關（r=0.84）；二者的t檢驗結果比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論相對平板涂布法，平板點樣法計數更客觀準確，檢測范圍更寬，操作更便捷，適用于菌液濃度的確定。
在臨床細菌診斷試劑盒的評價過程中，菌液濃度的確定是參考品制備的關鍵步驟，因此菌液濃度的測定方法應當準確、便捷。目前，菌液濃度的測定和參考品的制備常用濁度法（包括比濁法、分光光度法等）和平皿計數法，但濁度法難以區分活菌與死菌，以及與微生物大小類似的雜質。傳統用于測定菌液內活菌量的方法主要是平板涂布法。此方法雖結果較為準確，但可計數濃度范圍窄，且人眼計數不夠客觀；操作復雜，所需時間較長，當制備大批量參考品時，其計數工作量也變得不可忽視，更易因疲勞而使誤差變大。
平板點樣計數法是調理吞噬實驗（opsonophagocytic assay，OPA）中的細菌濃度檢測方法。調理吞噬實驗是評估肺炎球菌疫苗效價的實驗方法，其原理是用肺炎球菌疫苗免疫后的血清樣本（抗體）、HL-60細胞和補體構建體外型別特異性抗體介導的調理吞噬模型，對一定濃度的肺炎鏈球菌進行清除，之后通過檢測體系中存活肺炎鏈球菌的濃度計算出血清樣本中的功能抗體活力，實現對肺炎球菌疫苗保護效力的準確評估。近年來，美國阿拉巴馬大學通過長期探索，建立了優化的多重調理吞噬實驗（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同時對4種血清型的肺炎球菌功能抗體進行檢測，簡化了實驗流程，減少了工作量并節約血清樣本，更使得OPA技術的檢測通量成倍提高。此實驗方法準確高效，被WHO推薦用于肺炎球菌疫苗的功能性抗體檢測，且國外部分藥企已經開始采用。其中檢測存活肺炎球菌濃度所用的平板點樣方法是該實驗實現高效便捷的關鍵步驟。
在目前申報檢驗的臨床細菌診斷試劑盒中，A群鏈球菌抗原檢測試劑盒申報較多、應用較廣，且A群鏈球菌與肺炎球菌寄生部位接近，培養條件較相似。因此本實驗選用A群鏈球菌抗原檢測試劑盒的國家參考菌株制備懸液，參考調理吞噬實驗中平板點樣的方法，同時與傳統平板涂布法比較驗證，建立一種更快速簡便的活菌濃度檢測法。
1材料與方法
1.1一般材料
菌株是由中國醫學微生物菌種保藏管理中心提供A群溶血性鏈球菌CMCC32300、CMCC32301、CMCC32067。試劑是注射用生理鹽水；MH培養基（Bacto）、羊血（陸橋公司）；Todd-Hewitt Broth（Bacto）、酵母提取物（Bacto）、瓊脂（Bacto）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC（Amresco）、水。培養基為10%羊血培養基：MH培養基10.5 g；水500 mL；在使用前融化培養基，溫度冷卻至50～60℃時加入羊血50 mL混勻。THYA培養基：Todd-Hewitt Broth培養基12 g；酵母提取物2 g；瓊脂6 g；水500 mL。上層培養基：Todd-Hewitt Broth培養基24 g；酵母提取物4 g；瓊脂6 g；水800 mL。TTC儲液：TTC 1.25 g；水50 mL，用0.22μm濾膜過濾除菌后，于4℃保存。溶液呈淡黃色；若顏色變紅，廢棄，重新制備。
1.2儀器
電子天平（ME204）購自瑞士METTLER TOLEDO儀器（上海）有限公司；恒溫培養箱（LRH-250-Ⅱ）購自廣東省醫療器械廠；恒溫水浴鍋（XMTD-6000）購自北京市長風儀器儀表公司；超凈工作臺（SG-603TX）購自BAKER公司；立體菌落計數儀購自丹麥Biosense公司；顯微鏡（BX51）購自日本OLYMPUS公司；振蕩器（QL-901）購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
1.3樣品制備
1.3.1菌懸液制備將A群溶血性鏈球菌CMCC32067、CMCC32300、CMCC32301凍干粉復蘇后，制成懸液涂布在羊血培養基平板上，在37℃過夜培養。將平板上的菌體刮至10 mL注射用生理鹽水中，制成均一菌懸液。
1.3.2梯度稀釋將CMCC32067制備7份菌懸液，將其中5份進行1/10系列稀釋8個梯度，另外2份做1/2系列稀釋18個梯度；將CMCC32300和CMCC32301各制備1份菌懸液，并進行1/10系列稀釋8個梯度。
1.4平板點樣
1.4.1培養基準備將THYA培養基融化后，倒于13 cm×13 cm方形培養皿中，25 mL/板；凝固后在超凈臺內開蓋吹30～45 min，備用。將上層培養基融化后保存于50℃水浴中1～2 h，確保溫度至50℃，備用。
1.4.2平板點樣1/10梯度稀釋每個濃度菌液以及1/2梯度稀釋的后8個濃度的菌液，分別取10μL滴在THYA方形培養皿左側，每點完一個樣品立即傾斜平板，使菌液滴流成2～3 cm長，每個梯度做兩個平行。待所有樣品點完后，室溫放置20～30 min，讓菌液吸收到瓊脂板上。從水浴中取出上層培養基，取25 mL入25μL TTC儲液混勻，從板子邊緣緩慢傾倒在點樣的THYA平板上。待上層培養凝固，倒置于37℃孵箱中培養過夜，
1.4.3菌落計數用菌落計數儀統計每個點樣條的菌落數。
1.5平板涂布
分別取各系列菌液中的部分梯度50μL或100μL菌液均勻涂布于羊血平板，各做兩個平行，倒置于37℃孵箱中培養過夜，手動計數。
1.6統計學方法
將7份菌懸液的各稀釋梯度用兩種平板計數法計數，再用各個梯度的計數結果分別折算出初始濃度，采用SPSS 13.0對兩組結果進行相關性分析和成對t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。
2、結果與討論
在本實驗中，用不同菌株、不同稀釋方法且多次重復試驗，平板點樣法的結果均隨菌液稀釋梯度呈現出較好的梯度。比較了平板點樣法與平板涂布法計數7份CMCC32067的菌懸液的不同濃度梯度，以及不同的血平板點樣量，結果均顯示出高度相關性，且差異無統計學意義；用兩種平板計數方法計算另外兩株A群溶血性鏈球菌菌液濃度，同樣具有較好的一致性。比較兩種計數方法的操作性和準確性，發現平板點樣法點樣區域小、點樣量少，計數簡便，因而可檢測的濃度范圍比平板涂布法較寬。
用多個稀釋度的濃度檢測結果計算初始菌液濃度顯示，測定結果隨稀釋度提高略有升高，分析原因可能為：①存在稀釋過程中的操作誤差；②點樣區域有限，在稀釋度低時菌液濃度高，菌落密集且大小不均，容易漏計或合并計數，造成計算結果偏低；高稀釋度時菌液濃度低，菌體可能未落在點樣區域，造成平行孔之間CV值較大，濃度計算不準確。根據結果分析，選擇菌落數在20～100個之間的點樣區計算菌液濃度的偏差較小，點樣濃度最好在2×104～2×102 cfu/mL，將同一菌液的多個梯度的計數結果平均，計算初始菌液濃度更為準確。
由于平板點樣法所需樣品量少、點樣區域小，可以在一塊方形培養皿里同時檢測多個稀釋度或多種菌液。若待檢樣品多，還可以將初始菌懸液用移液器在96孔板中梯度稀釋后，再用多道移液器同時點樣多個梯度或多種菌液，操作更加便捷。且此方法用儀器自動計數，并且可以根據情況進行手動調整，準確度和效率更高，減少了傳統平板涂布法的涂布不均和人眼計數誤差。
對于其他細菌檢測試劑盒，當制備試劑盒評價參考品時，如果其抗原菌株不能在THYA培養基上生長，如淋病奈瑟菌等，在測定參考品濃度時可篩選出適宜其生長的且透明度好的培養基點樣，以便于TTC顯色后用儀器計數，這部分研究將在本室的后續工作中進行。
綜上所述，相較于平板涂布法，用平板點樣法檢測菌液濃度更加快捷，簡便，上樣量少，且檢測結果更準確客觀，檢測范圍寬，平均多個梯度后計算更加縮小了誤差，可以用于大批量試劑盒參考品的制備。