不同濃度苦瓜葉片提取液對農(nóng)桿菌生長曲線的影響
苦瓜（Momordica Charantia L.）系葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica）攀緣性草本植物。多種古籍記載，苦瓜葉片具有治療胃痛、痢疾、療瘡腫毒和驅(qū)蟲等功效。近年來，有文獻報道苦瓜果實提取物具有良好的廣譜抗菌功效，對革蘭氏陽性球菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭氏陽性桿菌（如枯草桿菌）和革蘭氏陰性桿菌（如大腸桿菌）等具有明顯的抑菌效果。苦瓜葉片作為果實以外的副產(chǎn)物，雖然無法食用，但其提取物能夠有效抑制某些農(nóng)業(yè)害蟲，如小菜蛾、斜紋夜蛾、美洲斑潛蠅等，因此可以作為綠色環(huán)保的害蟲抑制劑應用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。目前研究多針對苦瓜葉片提取物對農(nóng)業(yè)害蟲的抑制作用，對菌類抑制作用的報道較少。
農(nóng)桿菌（Agrobacterium）是一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，生活在植物根表面，依靠由根組織滲透出來的營養(yǎng)物質(zhì)生存。農(nóng)桿菌吸附在植物根部后，將自身DNA導入到植物根部，被侵染的植物會出現(xiàn)根部膨大、生長緩慢、矮小等癥狀。
本研究以無水乙醇為萃取液，制備苦瓜葉片提取液并處理農(nóng)桿菌，觀測其生長情況。目的是為進一步研究苦瓜葉片的抗菌機制提供參考，也為其開發(fā)利用提供科學依據(jù)。
1材料與方法
1.1供試菌種與植物
菌種：農(nóng)桿菌，天津師范大學生命科學學院欒維江教授實驗室提供。
植物：苦瓜（長豐三號），由天津市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供種子，在天津市西青區(qū)精武鎮(zhèn)種植。采收葉片，用去離子水洗凈，真空干燥后保存?zhèn)溆谩?
1.2實驗方法
1.2.1苦瓜葉片乙醇提取液的制備
具體制備方法參照文獻
1.2.2液態(tài)培養(yǎng)基的制備
取250mL雙蒸水，加入蛋白胨2.5g，酵母粉1.25g，氯化鈉2.5g，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，加熱滅菌后，每4mL為1份，分裝至試管中。每份加入4μL利福平抗生素，將制備好的液態(tài)培養(yǎng)基混勻，備用。
1.2.3實驗處理
將苦瓜葉片提取液設置4種質(zhì)量濃度（3.1、6.3、12.5、25.0g/L），同時用清水（CK1）和乙醇（CK2）作為對照，共設6個處理，每個處理重復3次。分別在各處理組中加入制備好的液態(tài)培養(yǎng)基1份，同時接種農(nóng)桿菌，將各處理菌液置于28℃、200r/min環(huán)境下培養(yǎng)。對菌液每12h進行1次吸光度值D（λ）600的測量。因苦瓜葉片乙醇提取液本身為綠色，為消除提取液自身顏色對吸光度的影響，另配制每個濃度下未接種農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基，測量吸光度值。最終測量值為含菌培養(yǎng)液的吸光度值減去不含菌培養(yǎng)液的吸光度值。
1.3數(shù)據(jù)處理
以SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理和方差分析。
2結(jié)果與分析
根據(jù)在600nm處測得的培養(yǎng)基吸光度值的變化，可以看出不同處理濃度和不同時間農(nóng)桿菌的生長情況，結(jié)果如表1所示。
表1農(nóng)桿菌培養(yǎng)液在不同時間的D（λ）600
由表1可以看出，CK1和CK2處理組D（λ）600相近，都顯著高于苦瓜葉片乙醇提取液中的D（λ）600.隨著提取液濃度的增大，農(nóng)桿菌培養(yǎng)液的D（λ）600呈下降趨勢，但在6.3、12.5和25.0g/L 3個處理濃度下，培養(yǎng)液D（λ）600的差異沒有統(tǒng)計學意義。
為了更清晰地分析苦瓜葉片提取液對農(nóng)桿菌生長的影響，作生長曲線如圖1所示。
圖1農(nóng)桿菌的生長曲線
從處理濃度上來看，在4個時間段中，苦瓜葉提取物質(zhì)量濃度為3.1g/L的處理組與其余各處理組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）。由圖1可以看出，在處理12h時，質(zhì)量濃度為3.1g/L的處理組與6.3、12.5、25.0g/L處理組之間就開始出現(xiàn)差異，同對照組相比，此時農(nóng)桿菌的生長已受到抑制，證明該濃度即為抑制農(nóng)桿菌生長的有效濃度。隨著處理時間的延長，D（λ）600均逐漸增大，表明培養(yǎng)液中農(nóng)桿菌數(shù)量逐漸增多。4個苦瓜葉提取物處理組的吸光度值均顯著低于2個對照組，表明苦瓜葉提取物對農(nóng)桿菌具有抑制作用。其中質(zhì)量濃度為3.1g/L處理組的農(nóng)桿菌生長曲線同其他處理組始終差別較大，而且隨著作用時間的延長，差別也逐漸增大。其余3種濃度下農(nóng)桿菌的生長曲線基本重合，由此可見，這3種濃度的苦瓜葉提取物對農(nóng)桿菌的抑制效果近似。
從作用時間來看，對照組、質(zhì)量濃度為3.1g/L處理組在4個時間段的菌液濃度始終呈上升趨勢；質(zhì)量濃度為6.3、12.5、25.0g/L的處理組在36h之前為農(nóng)桿菌的快速生長期，36h和48h之間菌液濃度達到最大，這說明處理時間達到36h后，農(nóng)桿菌數(shù)量趨于穩(wěn)定。
由此表明，4個苦瓜葉提取物處理組中，質(zhì)量濃度為3.1g/L的提取物開始對農(nóng)桿菌產(chǎn)生顯著的抑制效果，但抑菌能力出現(xiàn)大幅度變化的臨界質(zhì)量濃度為6.3 g/L，濃度再增大時，抑菌效果已沒有顯著提升。
3結(jié)論
本研究表明，苦瓜葉片提取液確實可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長。在4個處理濃度中，以6.3 g/L為抑制農(nóng)桿菌生長的最適處理濃度。在4個時間段中，以24h為最佳的處理時間。
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