PlcR在炭疽芽胞桿菌A16R中對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)、溶血酶活性及神經(jīng)磷脂酶活性影響（一）
炭疽芽胞桿菌()、蠟樣芽胞桿菌()和蘇云金芽胞桿菌()均屬于蠟樣芽胞桿菌群，在遺傳學(xué)上有很高的相似性。PlcR(Phospholipase C regulator)在蠟樣芽胞桿菌中是十分重要的調(diào)控因子，但基因在炭疽芽胞桿菌中發(fā)生一個(gè)無(wú)義突變導(dǎo)致在炭疽芽胞桿菌中產(chǎn)生一個(gè)截短PlcR蛋白。為了研究基因?qū)μ烤已堪麠U菌功能的影響，文章以蠟樣芽胞桿菌CMCC6330基因組為模板，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-后導(dǎo)入炭疽芽胞桿菌疫苗株A16R中獲得重組菌株，對(duì)其進(jìn)行表型分析。結(jié)果顯示，炭疽芽胞桿菌重組菌株的溶血活性基本沒(méi)有恢復(fù)，但恢復(fù)了部分神經(jīng)鞘磷脂酶活性，表明將蠟樣芽胞桿菌的基因?qū)胩烤已堪麠U菌后，可以直接激活神經(jīng)鞘磷脂酶活性。
PlcR是廣泛存在于蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中十分重要的多功能調(diào)控因子，它可激活多種編碼毒力因子的基因表達(dá)，如神經(jīng)鞘磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。在蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中，PlcR蛋白受PapR的激活，PapR在的控制下以前肽形式表達(dá)后通過(guò)SecA分泌機(jī)制輸出到細(xì)胞外，在胞外成為激活的五肽形式后，再通過(guò)寡肽透性酶系統(tǒng)Opp進(jìn)入細(xì)胞，與PlcR結(jié)合并激活PlcR，從而與PlcRbox結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控染色體上的幾十個(gè)基因。改變基因的序列可使蠟樣芽胞桿菌與蘇云金芽胞桿菌中的溶血素和細(xì)胞毒素的表達(dá)與活性減弱。在蠟樣芽胞桿菌PlcR缺失株中，一些蛋白質(zhì)如：神經(jīng)鞘磷脂酶、溶血素、腸毒素及許多蛋白酶是不表達(dá)的。炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌屬于蠟樣芽胞桿菌群，炭疽芽胞桿菌中存在與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌同源的基因序列，但在炭疽芽胞桿菌當(dāng)中基因發(fā)生了一個(gè)無(wú)義突變，導(dǎo)致其提前終止，故無(wú)法發(fā)揮其正常的功能。本文將蠟樣芽胞桿菌的基因?qū)胩烤已堪麠U菌減毒疫苗株A16R(pXO1+pXO2-)中并對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)、溶血酶活性及神經(jīng)磷脂酶活性進(jìn)行研究。
1材料和方法
1.1菌株及質(zhì)粒
本實(shí)驗(yàn)中用到的菌株及質(zhì)粒見(jiàn)表1。
1.2方法
1.2.1 PlcR在A16R中的表達(dá)
1.2.1.1表達(dá)載體pBE2A-構(gòu)建以CMCC-63301基因組為模板，用引物_F/R(表2)擴(kuò)增編碼區(qū)片段，用HⅠ和Ⅰ酶切后連接到本實(shí)驗(yàn)室保存的載體pBE2A上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-，在該重組質(zhì)粒中，基因處于枯草芽胞桿菌淀粉酶基因啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-轉(zhuǎn)化到DH5α中，測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌SCS110中去甲基化，后提質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到炭疽芽胞桿菌中疫苗株A16R中構(gòu)建pBE2A-/A16R，同時(shí)把表達(dá)載體pBE2A也導(dǎo)入A16R中，構(gòu)建pBE2A/A16R的用作對(duì)照。
1.2.1.2 PlcR表達(dá)、純化及抗PlcR多克隆抗體制備為了將來(lái)檢測(cè)基因是否在炭疽芽胞桿菌中中表達(dá)，我們制備了抗PlcR多克隆抗體，具體方法是：以CMCC63301基因組為模板，用引物pET_F/R(表2)擴(kuò)增片段，用HⅠ和dⅢ酶切連接到pET32a載體上，將構(gòu)建好的質(zhì)粒化學(xué)轉(zhuǎn)化到DH5α中，測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)中，構(gòu)建pET32a-/BL21，同時(shí)用相同的方法構(gòu)建pET32a/BL21。
注：下劃線部分表示限制性酶切位點(diǎn)。
pET32a-/BL21誘導(dǎo)表達(dá)判斷蛋白的可溶性，用可溶性蛋白純化試劑盒純化蛋白。獲得純化好的蛋白后采用背點(diǎn)注射和腹腔注射免疫小鼠。一周后鼠尾取血ELISA測(cè)效價(jià)，效價(jià)比較高時(shí)開(kāi)始眼球取全血，制備鼠多克隆抗體血清。
1.2.1.3 Western blot分析確認(rèn)PlcR在炭疽芽胞桿菌中表達(dá)將構(gòu)建的重組菌株pBE2A-/A16R和pBE2A/A16R培養(yǎng)13 h，各收集1 mL培養(yǎng)菌液，離心棄上清，菌體用200μL純水重懸，加入等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用上述制備的PlcR小鼠多抗進(jìn)行免疫印跡分析，使用低溫凝膠成像儀照相。
1.2.2表型分析
1.2.2.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定
在LB瓊脂平板上挑取A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，轉(zhuǎn)接到含5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，在搖床中37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，吸取50μL轉(zhuǎn)接至新鮮5 mL LB試管中同樣條件下培養(yǎng)12 h。吸取1 mL的菌液，轉(zhuǎn)接于含100 mL LB的500 mL三角瓶中培養(yǎng)(37℃，220 r/min)。每隔1 h取出三角瓶，測(cè)定600并記錄，繪制成生長(zhǎng)曲線。
1.2.2.2溶血現(xiàn)象觀察
在平板上挑取蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、炭疽芽胞桿菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，接到5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃、220 r/min培養(yǎng)13 h，將已滅菌的濾紙片貼到綿羊血平板后，吸取5μL菌液滴到濾紙片中間待菌液晾干后放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，觀察是否有溶血環(huán)及溶血環(huán)大小。
1.2.2.3神經(jīng)鞘磷脂酶活性觀察
在平板上挑取蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、炭疽芽胞桿菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃、220 r/min培養(yǎng)菌株13 h，各吸取5μL菌液滴加到配制好的卵磷脂瓊脂培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基+50%葡萄糖水溶液+50%卵黃鹽水懸液)中待菌液晾干后放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，觀察是否有乳白色神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)及消化環(huán)大小。
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