恒河猴肺中陰溝腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗——摘要、材料和方法
陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)在自然界中廣泛存在，在人和動物的糞便、水、泥土、植物中都可檢出。該菌為條件性致病菌，特定條件下能感染呼吸系統、泌尿系統等多個器官系統，同時也可感染創口，嚴重時引發敗血癥等。老年人和抵抗力降低的病人是該菌的易感人群。該菌也可導致兒童腦膜炎、腦梗塞、腦膿腫和腦囊腫等疾病，甚至引起死亡。因此，陰溝腸桿菌已成為引起醫院內感染的一種重要的病原菌。另外，陰溝腸桿菌B29是國際上公認的“肥胖細菌”，它是造成肥胖的直接元兇之一。大量研究報道，由于抗生素類藥物的不合理使用，使陰溝腸桿菌對多種抗菌藥物具有較高的耐藥性，陰溝腸桿菌普遍對第一代至第四代頭孢類、青霉素類等藥物有90%以上的耐藥率，這為臨床用藥的選擇帶來很大困難。經過多年對恒河猴的飼養觀察發現，恒河猴呼吸系統疾病發病率高，嚴重時可引起死亡。本文首次在恒河猴的肺組織中分離到陰溝腸桿菌，通過藥物敏感性試驗，確定治療陰溝腸桿菌的首選藥物，為今后的臨床治療工作提供依據。
1、材料和方法
1.1實驗動物
普通級雄性恒河猴1只，8歲，體重約7 kg。健康KM小鼠10只，雌性，6～8周齡。恒河猴及KM小鼠均來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所醫學靈長類研究中心(恒河猴生產許可證號[SCXK(滇)K2015-0004]，使用許可證號[SYXK(滇)K2015-0006];KM小鼠生產許可證號[SCXK(滇)K2014-0002]，使用許可證號[SYXK(滇)K2014-0007])。實驗內容經本單位動物實驗倫理審查委員會審查通過(批準號:DWSP201902034)，實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予實驗動物人道的關懷。
1.2主要試劑與儀器
SS瓊脂、GN增菌液、三糖鐵瓊脂，ID 32 E生化鑒定試條，藥敏紙片。電熱恒溫培養箱、ATB Expression儀。
圖1恒河猴病變
1.3實驗方法
1.3.1病例資料
該恒河猴身體健康，由人工飼養，每日喂以基礎飼料，自由飲水。每日清洗猴籠，定期消毒。通過日常飼養觀察發現該恒河猴表現為呼吸困難，精神沉郁，厭食，活動減少等癥狀，立即轉入治療室單籠飼養及治療，靜脈輸液青霉素(80萬單位/次)3 d后病情好轉，停藥觀察，該猴精神及飲食情況并未完全恢復。在治療室內隔離觀察20 d后放回大籠飼養，于放回大籠第2天死亡。尸檢外觀可見腹部鼓氣(見圖1A)，解剖心臟、肝、脾、胰腺、腎、腎上腺、膀胱未見異常，胃、腸管內充氣(見圖1B)，部分腸道呈出血性炎性變化，雙肺下呈充血、出血，邊緣部分肉樣肺炎病變(見圖1C)。
1.3.2病料采集及培養
解剖柜條件下解剖死亡猴，用無菌手術剪切開肺組織，用滅菌接種環在肉眼病變明顯和正常肺組織部位采樣，接種于GN增菌液，在恒溫培養箱(37℃)內增菌8 h后，接種SS瓊脂培養基，將平皿倒置放于37℃恒溫培養箱中培養18～24 h后觀察結果。
1.3.3細菌分離培養
挑選SS瓊脂培養基上典型菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂鑒別培養基，置于37℃恒溫培養箱中培養18～24 h，作進一步的分離培養和產酸產氣等培養特征的鑒定。同時挑取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。
1.3.4細菌生化鑒定
細菌生化鑒定采用法國生物梅里埃公司ATB細菌鑒定系統及配套ID 32E鑒定卡。按照說明書，在鑒定卡中加入樣品后放37℃培養箱內培養，18～24 h內觀察生化反應結果。將反應結果編號輸入ATB鑒定系統，判定結果。
1.3.5藥敏試驗
用紙片擴散法，對分離到的細菌進行常用抗菌類藥物的敏感性試驗。平皿置于37℃培養24 h后取出，觀察并測量抑菌圈直徑大小(mm)。結果判定按美國CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準進行。所用8種藥敏試紙片如下表。
表1藥敏紙片及規格
1.3.6病理檢查
取肉眼見明顯病變部位，4%甲醛溶液固定后制作病理切片，HE染色，鏡檢。
1.3.7小鼠致病性試驗
用滅菌生理鹽水將分離純培養的細菌稀釋，ATB比濁儀調整菌液濃度為4 McF。設立實驗組和對照組，實驗組6只小鼠，腹腔注射菌液0.5 mL/只，對照組4只小鼠，腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。記錄發病及致死情況，解剖死亡小鼠，記錄病理變化，無菌條件下采集肺臟組織進行細菌分離培養。