模擬失重條件下大腸埃希菌轉錄組測序、差異基因及富集分析結果（二）
隨著我國航天事業的飛速發展，航天員在空間站工作的時間越來越長，在航天多種特殊環境中，失重一直是研究者們最為重視的一種環境。有研究表明，在航天失重環境中，人體的免疫力會有所下降，使航天員的身體對抗各種致病微生物的能力下降。同時，長期寄居于人體的正常菌群及條件致病菌在航天特殊環境中也同樣會受到失重環境的影響。在航天飛行期間，這些細菌可以在失重條件下發生毒力、耐藥性變化等，導致其致病性增強，從而使航天員患感染性疾病的可能性增加，也可對航天環境中的空氣、水、食品安全性造成威脅。
大腸埃希菌是寄居于人體腸道內最常見的條件致病菌，在一定條件下可以引起胃腸道、泌尿道等多種局部組織器官感染，對人體健康具有潛在的威脅。既往研究表明，在模擬航天失重環境下，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌等的基因表達可發生相應的變化，如在模擬失重條件下培養大腸埃希菌K12后，統計分析后發現了16個上調基因和19個下調基因；與正常重力組相比，在模擬失重環境下培養肺炎克雷伯菌14 d，共有171個基因表達失調，包括負責3型纖維體及其調節因子的基因，可導致其生物膜形成能力增強；一項研究證實，模擬失重誘導了鼠傷寒沙門氏菌163個基因差異表達，包括10個Ⅲ型分泌系統毒力基因(表達下調)，以及其他轉錄調節劑、毒力因子、脂多糖生物合成酶、鐵酶利用和功能未知蛋白質的表達差異。寄生于人體內的大腸埃希菌長時間受到模擬失重環境的影響，會引起其基因表達變化，從而導致生物學性狀和毒力改變，繼而影響航天員健康和航天器環境生物安全。因此，研究模擬失重環境下大腸埃希菌基因表達的變化及其與生物學性狀變化間的聯系，可為航天員的身體健康提供保障，為未來的航天生物安全防護打好基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種大腸埃希菌(CICC 10389)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。
1.1.2試劑胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、RNA保存液、Total RNA Extractor購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Qubit 2.0 RNA檢測試劑盒、Qubit RNA檢測試劑盒、Qubit DNA檢測試劑盒購自美國Life Technologies公司；Ribo-off rRNA Depletion kit(bacteria)、VAHTSTMStranded mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina®、VAHTSTMDNA Clean Beads購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。
1.1.3儀器Gravite重力控制系統；恒溫培養箱；恒溫振蕩器；恒溫振蕩培養箱；生物安全柜；生物安全型離心機；Qubit 2.0熒光計、Qubit熒光計；微型漩渦混合儀；臺式高速低溫離心機；電泳儀；生物電泳圖像分析；微量分光光度計；PCR儀。
1.2方法
1.2.1培養基配置
溶菌肉湯(Luria-Bertani，LB)液體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，溶解在1 L雙蒸水中，121℃高壓滅菌30 min后，于4℃保存。
LB固體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，溶解在1 L雙蒸水中，121℃高壓滅菌30 min后，將液體倒入細菌培養皿中，凝固后放至4℃保存。
1.2.2大腸埃希菌培養
為明確模擬失重條件對大腸埃希菌基因的影響，把大腸埃希菌分為兩組(正常重力組和模擬失重組)進行比較。先將保存的單克隆甘油菌種接種到LB固體培養基上，37℃靜置培養12 h后，挑取單克隆菌落接種在裝有5 mL LB液體培養基的搖菌管中，37℃、200 r/min，過夜活化。將活化的菌液按體積比1∶500接種于裝滿新鮮LB液體培養基的培養瓶中(體積約73 mL)，排空氣泡。模擬失重組將接種好細菌的培養瓶放置在Gravite重力控制系統上旋轉培養，2 r/min，37℃；正常重力組將接種好細菌的培養瓶放置在恒溫振蕩器中，水平振蕩培養，2 r/min，37℃。每24 h按體積比1∶500接種于裝滿新鮮LB液體培養基的培養瓶中進行傳代，連續培養14 d。
1.2.3 RNA提取及質檢
運用Total RNA Extractor試劑盒，將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5～10 min，使得核蛋白與核酸完全分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。12 000 r/min 4℃離心10 min。吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min。12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清。加入1 mL乙醇(750 mL/L)洗滌沉淀。12 000 r/min 4℃離心3 min，棄上清。室溫干燥5～10 min。加入30～50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。將所得到的RNA溶液置于-70℃保存或立刻用于后續試驗。用Qubit 2.0檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。質檢結果顯示樣本質量均基本滿足建庫測序質量要求。
1.2.4原核RNA轉錄
組建庫該部分委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。具體步驟參照實驗說明書。
1.2.5基因表達差異分析采用TMM對read count數據進行標準化處理，之后運用DEGseq進行差異分析，為了得到顯著差異的基因，我們將篩選條件設為：P≤0.05且|log2(Fold Change)|≥1。
1.2.6關鍵靶點的GO和KEGG富集分析借助GO數據庫和KEGG數據庫，使用clusterProfiler進行功能富集分析，P<0.05表示該功能存在顯著富集情況。