廣西牛肺炎支原體病原的分離和鑒定、藥敏實驗分析（上）
近幾年來廣西從外省引進肉牛飼養的現象很普遍，因運輸應激因素誘發呼吸系統癥狀的疾病經常發生，臨床表現為發熱、流涕、咳嗽和呼吸困難，最終導致死亡。給養殖戶造成很大的經濟損失。為了弄清病因，2013年8月我們對桂林市某牛場出現的類似病例進行了病原調查。該場原有存欄牛336頭，2013年7月11日從北方某省引進肉犢牛93頭，到場后隔離觀察，第3天發現有牛出現喘氣，體溫升高。隨后多數牛也開始發病并出現嚴重的呼吸困難，臥地不起，拉稀或血樣糞便，部分牛最后因衰竭而死。曾用頭孢類抗生素治療無效，整個病程27頭牛發病，死亡7頭，發病率和病死率分別為29%（27/93）和25.9%（7/27）。剖檢病死牛，病變局限在胸腔與肺部，肺尖葉、心葉和膈葉都表現出不同程度的紅色肉變，肺間質增寬，還可見大小不等的黃白色壞死灶，氣管、支氣管里有大量的乳白色泡沫。胸腔有少量積液，心包積水，液體呈清亮黃色。其他臟器未見肉眼可見病理變化。經對病原分離培養、形態學觀察、生化試驗和病原特異性基因PCR檢測，鑒定該病病原為牛支原體。
1材料與方法
1.1試驗材料
病死牛肝、腎、肺、淋巴結。
1.2試劑和儀器
PPLO肉湯粉，購自杭州百思生物技術有限公司；瓊脂、TSA瓊脂、酵母，購自北京陸橋生物技術有限責任公司；馬血清，購自廣東蕊特生物科技有限公司；青霉素，購自山東魯抗醫藥股份有限公司；微生物生長動態監測系統oCelloScope，購自丹麥Biosense；微量DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker2、PCR Taq Mix，購自廣東東盛生物科技有限公司；PCR儀，購自日本TaKaRa公司；凝膠成像系統，購自美國Alpha Inotech公司。
1.3方法
1.3.1病原分離、形態觀察、細菌L型實驗和生化性狀測定等均按石磊的方法進行。
1.3.2病原PCR鑒定
按李大偉的方法進行病原的牛支原體特異性基因opp D/F的PCR鑒定，同時應用牛傳染性胸膜肺炎特異性引物對樣品進行鑒別診斷。將PCR擴增產物連接到pMD-18T載體中，對獲得的克隆進行鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序和分析。
1.3.3藥敏試驗
oCelloScope可量化添加抗菌藥物后牛肺炎支原體的生長動力學，快速確定支原體的生長情況和對抗生素的耐藥性。
1.3.4其他細菌的分離
無菌取病牛肝、腎、肺、淋巴結分別接種TSA瓊脂培養基和兔血營養瓊脂培養基，37℃培養48 h觀察結果。
2結果
2.1病原的分離培養和菌落形態
初次培養時，將肺組織勻漿后的上清液接種PPLO培養液后3 d，培養基顏色開始變為棕黃色，繼續傳代培養時，培養基顏色變色時間縮短，在1——2 d，便可由紅色變為棕黃，培養液顏色均一，透亮無混濁現象。固體培養基上，2——4 d便可見針尖大小的菌落生長，在4X10倍視野下觀察所有平皿均有典型的“煎蛋樣”菌落出現，核心較厚，向下長入培養基中，周邊為一薄層的透明區（圖1）。
圖1病原菌落觀察（4X10）
圖2病原姬姆薩染色觀察（10X100）
2.2病原的染色形態觀察結果
分離的病原革蘭染色不易著色，難以觀察；姬姆薩染色呈紫藍色，菌體呈現明顯的多形態，多數呈球形，也有少數長短不一的桿狀或蝌蚪狀的菌體散在分布（圖2）。
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