朱鹮細胞系的建立、體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（二）
1.3細胞生長評價
參照Mosmann(1983)的方法,測定5、10、20和25代的細胞生長率。細胞按1×104個/mL密度接種于96孔培養板內,每孔接種180μL。37°C培養24 h后,每孔加入20μL濃度為5 mg/mL的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5)-dimethylthiazol(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,Sigma],重復做5個孔。繼續培養4 h,小心吸出上清,每孔加入150μL的DMSO,10 min后,于振蕩器上振搖10 min,并在酶標儀(BIORAD-680)上測定570 nm波長下的吸光度值(optical density value,OD)。以后每天按此方法測定5孔細胞的OD值,連續測定7 d。以培養時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞的生長曲線。
1.4免疫熒光染色法鑒定細胞來源
將對數生長期的細胞接種到置于6孔板內,且已滅菌的7 mm×22 mm蓋玻片上,培養24 h后吸去培養液,用冰冷的PBS漂洗3次;4%的多聚甲醛室溫下固定細胞15 min,用含0.03%Triton-100的PBS(PBST)漂洗3次,每次5 min;加入1%BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白,Amresco)室溫封閉20 min,PBS漂洗3次,每次5 min;分別加鼠抗人波形蛋白和鼠抗人平滑肌α-actin(肌動蛋白)單克隆抗體(1:200,Dako),4°C孵育過夜;PBS漂洗細胞3次,每次3 min,加入Cy3標記的羊抗鼠IgG二抗,37°C孵育30 min;PBST漂洗3次,每次5 min,用含DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,4',6-diamidino-2-phenylindole,Sigma)的封片液封片后,熒光顯微鏡下觀察并照相。
1.5細胞遺傳學分析
1.5.1染色體標本制備在細胞對數生長期,每10 mL培養液加入20μL秋水仙素(100μg/mL,Sigma),處理細胞60 min后棄去培養液;用0.25%胰酶消化細胞1～2 min,然后加入適量的生長液抑制胰酶作用;混勻細胞懸液,離心后棄上清,用0.075 mol/L KCl溶液低滲處理細胞15 min,離心后加入甲醇:冰乙酸(3:1)固定細胞3次;以空氣干燥法制片。
1.5.2染色體帶型分析
參照Seabright(1971),Summer(1972)和Goodpasture&Bloom(1975)的方法進行G帶、C帶和Ag帶顯示。
1.5.3熒光原位雜交參照Nie et al(2009)的方法,利用石鸻(Burhinus oedicnemus,鸻形目)的Z和W染色體特異探針與朱鹮的中期染色體進行熒光原位雜交,鑒別朱鹮的性染色體。
1.6圖像拍攝與分析
用裝有CCD攝像裝置的蔡司熒光顯微鏡(Axioplan 2,Zeiss company)和圖像分析軟件(CytoVision system,Applied Imaging Corp,UK)進行圖像拍攝和分析。
2結果與討論
2.1朱鹮皮膚細胞系的建立
在陜西朱鹮人工繁殖中心獲得兩只朱鹮(雌、雄各一只)的皮膚樣品后,置于運輸液中運送到昆明。原代培養15 d后,有細胞從組織塊周圍長出(圖1 A),繼續培養5 d后細胞長成致密單層(圖1 B),即可以1:2的比例進行傳代培養,以維持細胞增殖。我們對10代以前不同代數的細胞進行冷凍保存,成功建立了兩株朱鹮細胞系,分別命名為KCB 201253S（雄性)和KCB 2012055S（雌性)。細胞均為典型的成纖維樣細胞,且支原體污染檢測（熒光法)結果均為陰性。凍存的朱鹮細胞在復蘇后能夠正常生長,且生長速度與凍存前相比并未減低。
圖1培養的朱鹮細胞形態
為優化培養條件,我們選用了不同的培養基如DMEM、MEM和OPTI-MEM(GIBCO)同時培養朱鹮細胞,并添加相同比例牛血清,經比較發現OPTI-MEM培養基最適宜朱鹮細胞的生長。
為鑒別所建立的朱鹮細胞系的來源,我們采用免疫熒光染色的方法,用兩種不同的抗體對培養的朱鹮細胞進行免疫抗體染色。結果顯示在朱鹮細胞中鼠抗人波形蛋白抗體染色為陰性,而鼠抗人平滑肌α-actin抗體染色為強陽性(圖2,呈束狀的紅色熒光顯示肌絲特征)。鼠抗人平滑肌α-actin抗體只與血管平滑肌細胞中的actin的α異構體特異性結合,而與成纖維細胞中的β-、γ-actin均不能結合。因此該抗體可以作為血管平滑肌細胞的鑒定(Cai et al,2005)。免疫熒光染色的結果提示我們建立的朱鹮細胞系來源于血管平滑肌組織。體外培養細胞源于動物機體,而機體內的細胞都混雜生長,每一種組織都有血管和間葉組織,因此,由動物體來源的培養材料而進行的原代培養,絕大多數都呈各種細胞混合生長（Zhou,2006)。我們所取的朱鹮皮膚樣品中也含有血管,在剪小的組織塊中包含有血管平滑肌組織,在原代培養時包括血管平滑肌細胞在內的各類細胞均可從組織塊中長出,因此,可能在后續的傳代培養過程中,血管平滑肌細胞成為優勢細胞而保留下來。
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