磷濃度對(duì)海水鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)和預(yù)采收的影響（一）
螺旋藻（Spirulina）或節(jié)旋藻（Arthrospira）為藍(lán)藻門(mén)（Cyanophyta）、段殖藻目（Hormogonales）、顫藻科（Oscillatoriaceae）、螺旋藻屬（Spirulina）或節(jié)旋藻屬（Arthrospira）的藻類(lèi)。螺旋藻是目前蛋白質(zhì)含量最高的食品資源［1］，同時(shí)，螺旋藻還富含功能獨(dú)特的活性多糖、藻藍(lán)蛋白、γ-亞麻酸等生物活性物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥保健、化妝品及飼料等領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用［2］。研究表明，螺旋藻多糖對(duì)HIV病毒、丙肝病毒等多種病毒具有抑制作用［3］，而且其在抗腫瘤、抗氧化［4］、免疫調(diào)節(jié)、降血糖血脂以及修復(fù)DNA損傷等方面也表現(xiàn)出了良好的功效［5-6］。螺旋藻還含有豐富的藻藍(lán)蛋白，藻藍(lán)蛋白已被證實(shí)具有顯著的抗癌、抗炎癥等多種生物活性［7］，同時(shí)還能作為食用色素應(yīng)用于食品行業(yè)［8］。γ-亞麻酸對(duì)心血管疾病具有良好預(yù)防作用，而且是合成前列腺素E1的前體物質(zhì)［9］。
螺旋藻產(chǎn)業(yè)在國(guó)際上興起于20世紀(jì)80年代初，我國(guó)于90年代中期已成為國(guó)際上最大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)國(guó)［10］。利用天然海水培養(yǎng)螺旋藻，可顯著節(jié)約淡水資源，同時(shí)可利用灘涂、鹽堿地等環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，有效緩解農(nóng)用耕地日趨緊張的問(wèn)題，而海水中含有大量營(yíng)養(yǎng)元素，可大幅度降低螺旋藻培養(yǎng)的肥料成本。長(zhǎng)期以來(lái)，海水螺旋藻的研究得到全世界的普遍關(guān)注，但目前大多僅停留在實(shí)驗(yàn)室藻種選育階段。本實(shí)驗(yàn)室于20世紀(jì)80年代末至90年代初在國(guó)際上率先建立了全海水的螺旋藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，并與企業(yè)合作成功實(shí)現(xiàn)了海水螺旋藻的產(chǎn)業(yè)化，與傳統(tǒng)淡水螺旋藻養(yǎng)殖相比，其品質(zhì)得以顯著提高［11-12］。
磷是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的必需營(yíng)養(yǎng)因子之一，在大多數(shù)細(xì)胞過(guò)程中起著不可或缺的作用，特別是涉及能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、高分子生物合成、光合作用和呼吸的過(guò)程［13］。研究表明磷元素對(duì)許多藻類(lèi)脂質(zhì)［14-15］、蛋白質(zhì)［16］和多糖［17-18］的積累具有顯著影響。螺旋藻的主要成分及其含量可以通過(guò)多種培養(yǎng)條件來(lái)控制，如氮濃度［19］、光照強(qiáng)度［20］和溫度［21］。有關(guān)氮源、溫度和光照對(duì)螺旋藻的生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物影響研究十分廣泛，但磷源濃度對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)代謝影響的研究還很少，僅見(jiàn)2篇文獻(xiàn)對(duì)淡水螺旋藻的主要生化組分［22］和脂類(lèi)積累［23］影響的研究。對(duì)于磷濃度對(duì)海水螺旋藻生物量生產(chǎn)和生化組成的影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究磷對(duì)海水螺旋藻生長(zhǎng)和生化組成的影響對(duì)海水螺旋藻主要高值化產(chǎn)物生產(chǎn)以及海水螺旋藻產(chǎn)業(yè)具有重要的指導(dǎo)意義。本研究首次開(kāi)展不同磷源濃度的海水螺旋藻培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)分析磷源濃度對(duì)海水螺旋藻生長(zhǎng)及生化組成的影響規(guī)律，為通過(guò)磷調(diào)節(jié)來(lái)提高螺旋藻主要產(chǎn)物的產(chǎn)量、提升螺旋藻品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1藻株及保存條件海水鈍頂螺旋藻（Spirulina Platensis）藻種，由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所海藻資源與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。
藻種保存條件：培養(yǎng)溫度為25±1℃，熒光燈提供光源，培養(yǎng)光強(qiáng)為49-57μmol·photons m-2·s-1，光暗周期為12 h∶12 h。
1.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)以改良的Zarrouk海水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組成為：5 g/L NaHCO3，0.5 g/L NaNO3，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.08 g/L Na2EDTA，1 mL/L A5solution，以天然海水為基質(zhì)配制而成。通過(guò)補(bǔ)加去離子水將鹽度控制在28±1‰。K2HPO4·3H2O為磷源，加入不同的磷源濃度（終濃度分別為0.005、0.01、0.02，0.03和0.04 g/L），接種于500 mL錐形瓶，于溫度為25℃，光強(qiáng)為49-57μmol·photons m-2·s-1條件下，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶6次。培養(yǎng)結(jié)束后（培養(yǎng)周期10 d），離心收集藻泥，去離子水多次清洗，真空冷凍干燥獲得凍干粉，用于總糖、水溶性多糖、蛋白質(zhì)、藻藍(lán)蛋白、光合色素總脂以及脂肪酸含量的測(cè)定。
1.2方法
1.2.1生物質(zhì)濃度的測(cè)定利用干重法進(jìn)行測(cè)定。取一定量的藻液，用預(yù)先在80℃烘箱中烘干至恒重的混合纖維濾膜（0.45μm）進(jìn)行抽濾，再將有藻細(xì)胞的濾膜放置在80℃烘箱烘至恒重，用減差法得到微藻細(xì)胞干重。每個(gè)樣品重復(fù)3次計(jì)算平均值。
1.2.2總糖的提取及測(cè)定取10 mg藻粉，加入5 mL 0.5 mol/L H2SO4，于80℃水浴攪拌0.5 h，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。反復(fù)抽提3次，合并上清后定容到50 mL，得到總糖提取液；總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法［24］。
1.2.3水溶性多糖提取及測(cè)定取50 mg藻粉溶于水，超聲破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，70℃熱水浸提4 h，8 000 r/min離心10 min收集上清。反復(fù)抽提4次，合并上清并定容至50 mL得到水溶性多糖提取液；水溶糖含量通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定。
1.2.4胞壁多糖及總多糖的測(cè)定取上述提取水溶性多糖后所得藻渣，加入5 mL 0.5 mol/L H2SO4，于80℃水浴攪拌0.5 h，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。反復(fù)抽提3次，合并上清后定容到50 mL，得到胞壁多糖提取液［25］；采用苯酚-硫酸法測(cè)定其含量。
1.2.5蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用半自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定總蛋白質(zhì)含量，以蛋白質(zhì)的F值為6.25計(jì)算。
1.2.6藻膽蛋白的測(cè)定采用改良的Sigelman和Kycia法提取藻膽蛋白，分光光度法測(cè)定藻藍(lán)蛋白、異藻藍(lán)蛋白含量［26］。
1.2.7脂溶性光合色素測(cè)定取10 mg藻粉，置于10 mL玻璃離心管中，加入5 mL丙酮，避光冰浴攪拌提取1-2 d，直至藻體變白，3 000 r/min離心10 min收集上清得到色素提取液。采用分光光度法在662 nm、645 nm和470 nm下測(cè)定葉綠素a、總類(lèi)胡蘿卜素含量［27-28］，由下列公式計(jì)算：
色素含量（%DW）=（色素質(zhì)量濃度算×提取液體積）/藻體干重
1.2.8總脂的測(cè)定與分級(jí)總脂的提取與含量的測(cè)定采取改良的Khozin-Goldberg方法［29］。
1.2.9脂肪酸組成的測(cè)定稱(chēng)取25 mg凍干藻粉于10 mL玻璃離心管中，加入2 mL 2%H2SO4無(wú)水甲醇：甲苯（9∶1，V∶V），充入氮?dú)夂螅?0℃水溶攪拌1 h，再依次加入1 mL去離子水和1 mL正己烷，充分震蕩后3 500 r/min離心5 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，氮?dú)獯蹈桑偌尤? mL含有C17標(biāo)準(zhǔn)品的正己烷，并用孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾至1.5 mL的小玻璃瓶中，最后利用氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸。
1.2.10統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以平均值，最后利用氣相色譜SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水平儀=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Origin 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。
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