犬奇異變形桿菌及其噬菌體分離鑒定、生長曲線及藥敏試驗（二）
1.2.3細菌脲酶鑒定
參照W.B.Christensen等的試驗方法，將分離純化的細菌接種于尿素培養基上，37℃恒溫培養10～12 h后，觀察尿素培養基顏色變化。尿素培養基由橘黃色變紅色則表明細菌能夠產生尿素酶。
1.2.4 16 Sr R NA的擴增
參考細菌基因組提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，稀釋至濃度為20 ng·μL-1備用。設計細菌16S通用引物，引物序列為F5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′和R5′-GTTACCTTGTTACGACT-3′，預擴增片段大小約為1 500 bp。PCR擴增體系（總體積為50μL）：Rnase-free 2×Taq Mix 25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，H2O 19μL。擴增程序：94℃預變性90 s；94℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃再延伸5 min。使用DNA純化回收試劑盒切膠純化PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶大小無誤后送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果與GenBank中其他序列進行比對分析。
1.2.5藥敏試驗
挑取單個菌落置于LB培養基，37℃培養6～8 h，取100μL菌液滴入LB固體培養基中涂布均勻，將不同的藥敏紙片置于均勻涂滿菌液的LB固體培養基中，37℃培養24 h，測量抑菌環直徑，參照CLSI（2014）標準判定結果。
1.3噬菌體分離鑒定及生物學特性分析
1.3.1噬菌體的分離純化及電鏡觀察
取未處理污水經紗布初濾大顆粒雜質后加入CaCl2終濃度為1 mmol·L-1，6 000 g離心15 min除去其他雜質。采用透析袋濃縮離心后的污水上清4℃過夜，濃縮后的污水經0.22μM濾膜過濾除菌、備用。以分離到的菌液為宿主菌分離噬菌體，將100 mL除菌的濾液上清加入100 mL 2×LB培養基，滴入對數生長期的宿主菌100μL，37℃160 r·min-1振蕩培養12 h，10 000 g離心10 min，將上清經0.22μM濾器過濾除菌。將濾液和宿主菌充分混合，接種到融化的半固體培養基（瓊脂含量0.75%）充分混勻，倒入營養瓊脂平板中，凝固后置于37℃恒溫培養8 h，觀察噬菌斑的形成情況。挑取透明、形狀規則的噬菌斑，采用雙層平板法分離純化8～10次，可以得到純化的噬菌體。
為了進一步觀察vB_PmM_XNR的形態，采用透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。簡要步驟：取噬菌體懸液10μL（106PFU·mL-1）置于銅網，靜置20 min左右，用濾紙吸干多余液體，用負染液（2%磷鎢酸溶液）染色5 min，濾紙吸干染液后，用蒸餾水清洗2遍，干燥后置于透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。
1.3.2最佳感染復數測定及一步生長曲線
將細菌培養至對數生長期（約1×108CFU·mL-1），噬菌體與細菌各100μL，按照比例為100、10、1、0.1、0.01、0.001進行混合，室溫靜置10 min。37℃恒溫160 r·min-1振蕩培養4 h。雙層平板法測定噬菌斑個數，以噬菌體滴度增加最高比例的為最佳感染復數，重復3次取均值。
將對數生長期的分離株（OD600=0.3，約為1×108CFU·mL-1）和噬菌體按MOI等體積（各500μL）混合后，置37℃靜置孵育15 min，8 000 g離心5 min，棄上清。沉淀重懸于10 mL LB中，37℃搖床160 r·min-1振蕩培養。每間隔5 min取樣，測定不同時間點噬菌體滴度，繪制一步生長曲線。
1.3.3噬菌體溫度和pH穩定性實驗
將等體積噬菌體（108PFU·mL-1）分別置于不同溫度（4、25、37、42、60和70℃）條件下孵育1 h后，采用雙層平板法檢測噬菌體滴度變化，評價噬菌體熱穩定性。同樣，將等體積的噬菌體分別加到不同pH（pH=2.0～12.0）的緩沖溶液中37℃水浴中孵育1 h，檢測噬菌體滴度。
1.3.4氯仿敏感性檢測
取1 mL（108PFU·mL-1）噬菌體液加入氯仿（1%體積），充分混合15 s后置于室溫靜置30 min，待分層后取上層溶液測定滴度。
1.4體外裂解作用
將奇異變形桿菌PM-XNR培養至對數生長期，PBS（pH=7.4）洗滌去除培養基，并調整細菌濃度為108PFU·mL-1，加入1 mL效價約為108PFU·mL-1的噬菌體XNR于37℃靜置培養，分別于0、4、8、12、24 h測定培養液中細菌濃度以及噬菌體效價。
2結果與分析
2.1革蘭氏染色和生物學特性檢測
分離株在Baird-Parker瓊脂培養基上菌落呈圓形褐色，邊緣圍繞一圈透明帶，符合奇異變形桿菌在Baird-Parker瓊脂培養基上生長特性，如圖1 A所示。分離株經革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察呈紅色，無芽孢及莢膜，具有多形態性呈桿狀、球狀等（見圖1 B）；透射電鏡能夠清楚看到細菌形態，表面粗糙、有鞭毛（見圖1 C）；分離株在血瓊脂培養呈灰白色菌落，具有溶血現象，散發特殊的腐敗性臭味（見圖1 D）；分離株在尿素培養基中，培養18 h變為粉紅色，說明分離株產生脲酶分解尿素（見圖1 E），這也是泌尿系統產生結石的主要原因之一。通過上述革蘭氏染色和生物學特性實驗可以初步判定分離株為奇異變形桿菌。
圖1分離菌生物學特性及電鏡觀察結果
2.2 16Sr RNA序列同源性比較
細菌基因組經PCR擴增后，在1 500 bp左右出現單一條帶（圖2）。測序后BLAST分析比對，發現與其Query程度最高的幾種16SrRNA序列均為奇異變形桿菌，其Query程度均高達98%以上，因此可以確定分離到的菌株為奇異變形桿菌，命名為PMXNR。
圖2 16Sr RNA擴增結果
2.3藥敏試驗
18種藥品對PM-XNR進行藥敏試驗，其中該菌株PM-XNR對頭孢抗生素頭孢吡肟敏感，對阿米卡星、氨芐西林、左氧氟沙星、氯霉素和環丙沙星中度敏感；對其他使用的抗生素均耐藥。說明犬源奇異變形桿菌具有較強的耐藥性。
表1 PM-XNR藥敏試驗結果（抑菌圈直徑/mm）
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