羅爾阿太菌生長(zhǎng)曲線、原生質(zhì)體制備條件及融合技術(shù)（三）
2結(jié)果與分析
2.1羅爾阿太菌生長(zhǎng)曲線
通過(guò)測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線得知30——80 h菌體生長(zhǎng)旺盛，為羅爾阿太菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)制備原生質(zhì)體，可得到較高的原生質(zhì)體形成率和再生率。因此選用培養(yǎng)55 h的菌體用于原生質(zhì)體制備。
2.2原生質(zhì)體制備條件
2.2.1制備條件對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響
由圖1a可知在添加單一種類酶中，第3組溶壁酶的去壁和再生效果最好，原生質(zhì)體的形成率為71.343%，再生率為9.003%.而第1組纖維素酶和第2組蝸牛酶的形成率和再生率都偏低。第4、5、6和7組復(fù)合酶的形成率和再生率都高于單一酶，尤其是第5組復(fù)合酶原生質(zhì)體的形成率為92.765%，再生率為18.869%，效果最好。
由圖1b可知隨著復(fù)合酶濃度的增加，原生質(zhì)體的形成率逐漸增加，再生率逐漸降低。原因可能是隨著復(fù)合酶濃度的增加，細(xì)胞壁與酶分子接觸機(jī)會(huì)增加，細(xì)胞壁被酶解的幾率增大，因此形成率增大。但當(dāng)復(fù)合酶濃度過(guò)高時(shí)，不僅細(xì)胞壁被酶解，細(xì)胞膜也遭到嚴(yán)重破壞，致使原生質(zhì)體再生困難，造成再生率下降。當(dāng)復(fù)合酶為3.1 mg·mL——1時(shí)，原生質(zhì)體的形成率為93.133%，再生率為18.932%，綜合效果較好。
由圖1c可知當(dāng)溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體的形成率最高，為92.767%.當(dāng)溫度為32℃時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高。這是由于酶在其最適溫度下才能發(fā)揮最高活力，溫度低，只能酶解部分細(xì)胞壁，原生質(zhì)體形成率和再生率都不高。溫度高不利于原生質(zhì)體的形成，導(dǎo)致形成率和再生率下降。考慮到原生質(zhì)體再生是原生質(zhì)體滅活的關(guān)鍵，溫度采用32℃。
由圖1d可知隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體形成率逐漸提高，而再生率逐漸下降。原因可能是酶解時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞壁被水解的越完全，使原生質(zhì)體形成率提高，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，酶在酶解細(xì)胞壁的同時(shí)也會(huì)損傷細(xì)胞膜，使原生質(zhì)體再生困難，導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率下降，當(dāng)酶解時(shí)間為55 min時(shí)，原生質(zhì)體形成率為92.134%，再生率為17.332%，綜合效果較好。
由圖1e可知，pH 5.5時(shí)原生質(zhì)體的形成率和再生率均達(dá)最大值。這可能是由于pH 5.5處于蝸牛酶（5.0——5.8）、纖維素酶（4.0——5.5）、溶壁酶（5.4——6.0）的適宜范圍內(nèi)，酶解效果好，因此原生質(zhì)體形成率和再生率最高。
圖1制備條件對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響
由圖1f可知KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑破壁效果均優(yōu)于MgSO4、NaCl和蔗糖，原生質(zhì)體形成率和再生率分別為93.501%和18.867%.利用spss16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明Sig為0.000，差異極顯著，按照顯著性水平P＜0.05分成3列（KCl、NaCl和蔗糖、MgSO4），三者之間有著顯著差異，其中NaCl和蔗糖之間差異不顯著。這可能是由于KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑更易避免原生質(zhì)體膨脹破裂。因此采用KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行原生質(zhì)體制備。
2.2.2原生質(zhì)體制備最佳條件的選擇
原生質(zhì)體制備正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可以看出，極差R的分布大小依次為復(fù)合酶濃度（A）＞酶解時(shí)間（C）＞酶解溫度（B）＞滲透壓穩(wěn)定劑（E）＞pH（D）。這表明復(fù)合酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率影響最大，pH影響最小。原生質(zhì)體制備最佳組合條件為A2B2C3D2E3，即0.4 mol·L——1的KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，復(fù)合酶3.1 mg·mL——1，pH 5.5、32℃條件下酶解55 min，原生質(zhì)體形成率為93.534%，再生率為18.921%.
表2原生質(zhì)體制備正交試驗(yàn)結(jié)果
2.3紫外滅活和熱滅活對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響
紫外滅活和熱滅活對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響如圖2所示，由圖2a可以看出隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體致死率升高。紫外照射5 min，原生質(zhì)體致死率達(dá)98.6%，照射6 min，原生質(zhì)體致死率達(dá)100%，因此6 min為紫外滅活最佳時(shí)間。
圖2紫外滅活和熱滅活對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響
由圖2b可以看出，45℃熱處理60 min，55℃熱處理55 min，65℃熱處理40 min，原生質(zhì)體致死率均達(dá)100%.為了在最短時(shí)間內(nèi)達(dá)到滅活目的，選擇65℃熱處理40 min。
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