鵪鶉肺炎克雷伯菌血清型鑒定、耐藥性檢測及致病潛力（三）
2結(jié)果
2.1病原菌的分離培養(yǎng)及鏡檢染色結(jié)果
從8份腹瀉鵪鶉糞樣中成功分離到2株疑似菌落，其在LB瓊脂培養(yǎng)基上生長為表面光滑濕潤、邊緣整齊、形狀大而圓的灰白色菌落（圖1A）；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長為表面光滑濕潤、邊緣整齊，形狀小而圓的粉色菌落（圖1B）；在SS瓊脂板上生長為表面光滑濕潤、邊緣整齊的淡粉色菌落（圖1C），在各培養(yǎng)基上均為黏稠狀聚在一起，均伴有臭味。革蘭染色鏡檢呈兩端鈍而圓的紅色短桿狀菌落（圖1D），根據(jù)菌株形態(tài)可初步判斷2株分離株為肺炎克雷伯菌，分別命名為Ksp-A1和Ksp-A2.A-C,分離株在LB、麥康凱、SS瓊脂平板上的生長情況；D,革蘭染色鏡檢（1000×）
圖1病原菌菌落形態(tài)及革蘭染色鏡檢
2.2生化鑒定結(jié)果生化鑒定
結(jié)果顯示，2株分離菌株苯丙氨酸、鳥氨酸、半固體瓊脂、葡磷胨水、側(cè)金盞花醇、硫化氫和蛋白胨水試驗(yàn)均呈陰性，均能分解木糖、山梨醇、棉子糖，枸櫞酸鈉、尿素、葡萄糖酸鹽、賴氨酸和葡萄糖產(chǎn)氣反應(yīng)呈陽性（表4），參照腸桿菌科細(xì)菌生化反應(yīng)陽性率表，符合肺炎克雷伯菌生化特性。
表4分離株生化鑒定結(jié)果
2.316SrDNA鑒定和遺傳進(jìn)化分析
利用細(xì)菌16SrDNA通用引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，獲得大小約1490bp的片段（圖2），大小與預(yù)期相符。測序結(jié)果BLAST比對(duì)顯示，2株分離菌株與肺炎克雷伯菌的相似性達(dá)到99.50%-99.93%.系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，分離株均與肺炎克雷伯菌DB-4、WGT-31株屬于同一進(jìn)化分支（圖3），進(jìn)一步證明2株分離株為肺炎克雷伯菌。
2.4肺炎克雷伯菌特異性基因檢測結(jié)果
對(duì)分離株Ksp-A1和Ksp-A2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測其是否含有腸桿菌科特異性基因phoA與肺炎克雷伯菌特異性基因khe,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，分別獲得大小為720和498bp條帶（圖4），條帶大小符合預(yù)期，因此判斷2株分離株均為腸桿菌科肺炎克雷伯菌。
圖2分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）16SrDNAPCR擴(kuò)增結(jié)果
圖3分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹
圖4分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）肺炎克雷伯菌特異性基因PCR檢測結(jié)果
2.5肺炎克雷伯菌莢膜血清型檢測結(jié)果
2株分離株使用K57莢膜血清型特異性引物均擴(kuò)增出1100bp左右片段（圖5），片段大小符合預(yù)期，因此判斷分離株Ksp-A1和Ksp-A2的莢膜血清型均為K57.M,Trans2KDNAMarker;1,陰性對(duì)照；2-8,分別為K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57莢膜血清型
圖5分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）莢膜血清型PCR檢測結(jié)果
2.6藥物敏感性檢測結(jié)果
由表5可知，分離株Ksp-A1和Ksp-A2均對(duì)苯唑西林、氨芐西林、青霉素、復(fù)方新諾明、麥迪霉素和紅霉素表現(xiàn)耐藥，對(duì)頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢唑啉、米諾環(huán)素、氯霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星和諾氟沙星表現(xiàn)敏感，對(duì)頭孢氨芐、羧芐西林、多黏菌素B和新霉素表現(xiàn)中介。Ksp-A1對(duì)頭孢拉定、四環(huán)素和阿奇霉素表現(xiàn)中介，Ksp-A2對(duì)以上抗菌藥表現(xiàn)敏感；Ksp-A2對(duì)卡那霉素和慶大霉素表現(xiàn)中介，Ksp-A1對(duì)其表現(xiàn)敏感。
表5分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果
2.7耐藥基因檢測結(jié)果
使用PCR檢測分離株耐藥基因，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1攜帶blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat16種耐藥基因；分離株Ksp-A2攜帶blaSHV、aaaA1、aacC2、oqxAB、qnrA、tetA、tetM和cat18種耐藥基因（圖6）。
2.8分離株毒力基因檢測結(jié)果
分離株毒力基因檢測顯示，分離株Ksp-A1攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC6種毒力基因，分離株Ksp-A2攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA、ompC和malX7種毒力基因（圖7）。
2.9生物學(xué)特性分析
2.9.1生長曲線
由圖8A可知，培養(yǎng)2h后，分離株Ksp-A1和Ksp-A2的D600nm值均逐漸升高，開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。培養(yǎng)12h時(shí)，分離株Ksp-A1的D600nm值達(dá)到峰值，隨后進(jìn)入衰退期。培養(yǎng)9h時(shí)，分離株Ksp-A2的D600nm值達(dá)到峰值，隨后進(jìn)入衰退期。
2.9.2酸堿耐受性
由圖8B可知，分離株Ksp-A1、Ksp-A2在pH2.0-10.0均能存活，且pH為7.0時(shí)活性最好；當(dāng)pH<2.0和pH>11.0時(shí)分離株Ksp-A1基本失去活性；當(dāng)pH<2.0和pH>12.0時(shí)分離株Ksp-A2基本失去活性。
2.9.3接種量由圖8C可知，分離株Ksp-A1接種量為3%、Ksp-A2接種量為2%和3%時(shí)生長狀態(tài)最佳。在其他接種量條件下，2株分離株的D600nm值均呈現(xiàn)不同程度的下降，生長狀態(tài)較差，因此分離株Ksp-A1的最適接種量為3%、Ksp-A2的最適接種量為2%.
圖6分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）耐藥性基因檢測結(jié)果
圖7分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）毒力基因檢測結(jié)果
圖8分離株生長曲線（A）、酸堿耐受（B）與接種量（C）測定結(jié)果
2.10致病性試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)組小鼠在12h后開始發(fā)病，均出現(xiàn)被毛粗亂、精神沉郁、呼吸困難、腹瀉等癥狀。對(duì)照組小鼠試驗(yàn)期間活動(dòng)正常，未見異常。當(dāng)分離株Ksp-A1和Ksp-A2菌液濃度為0和1×105CFU/mL時(shí)，小鼠死亡率均為0;當(dāng)菌液濃度為1×106CFU/mL時(shí)，Ksp-A1組小鼠死亡率為0,Ksp-A2組小鼠死亡率為10%;當(dāng)菌液濃度為1×107CFU/mL時(shí)，Ksp-A1組小鼠死亡率為30%,Ksp-A2組小鼠死亡率為60%;當(dāng)菌液濃度為1×108CFU/mL時(shí)，Ksp-A1組小鼠死亡率為70%,Ksp-A2組小鼠死亡率為90%;當(dāng)菌液濃度為1×109CFU/mL時(shí)，Ksp-A1和Ksp-A2組小鼠死亡率均達(dá)到100%（表6）。經(jīng)計(jì)算得出，分離株Ksp-A1和Ksp-A2對(duì)小鼠的LD50分別為3.3×107和2.6×106CFU.
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