滸苔多糖降解微生物采集、分離、篩選、鑒定及生長曲線測定（二）
1.2滸苔多糖的提取
采取已建立的熱水浴加乙醇沉降的方法提取滸苔多糖，具體步驟為：將滸苔清洗干凈后，取適量于無菌水中，置于90℃水浴鍋水浴7 h，收集液體，重復(fù)操作2次。將所得液體離心（4 800g（g為重力加速度），15 min）去雜質(zhì)后濃縮至50 mL。加1/5提取液體積的氯仿正丁醇溶液（氯仿∶正丁醇=5∶1）劇烈震蕩30 min后離心，取水相，去除提取液中的蛋白質(zhì)，重復(fù)3次至無白色沉淀，收集上清液。將收集的液體用3倍體積的無水乙醇沉降，離心去上清，待干燥后加入適量無菌雙蒸水溶解備用。
1.3滸苔多糖降解微生物的篩選
將提取的滸苔多糖以5 g/L的終濃度加入無碳的海洋無機鹽培養(yǎng)基（minimum marine medium，MMM）中，該培養(yǎng)基含有25.95 g NaCl，2 g MgCl2·6H2O，3 g MgSO4·7H2O，0.12 g CaCl2·2H2O，27 mL 0.5 mol/L Na2EDTA，25 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH=8），10 mL 1 mol/L NH4Cl，0.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4，0.015 g FeSO4·7H2O，0.03 g H4MoNa2O6，1 mL微量元素混合液（含H3BO3 2.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.86 g/L，Zn SO4·7H2 O 0.22 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g/L）和1 mL 1 000*維生素混合物。將分離到的菌株接種到以滸苔多糖為唯一碳源的MMM液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)，根據(jù)生長情況判斷各菌株對滸苔多糖的利用能力，篩選出能利用滸苔多糖的菌株。同時，按照BIOLOG使用方法，用PM2A碳源利用板測試幾株菌對PM2A板上各碳源的利用情況。
1.4滸苔多糖降解菌的生長曲線測定
為了測試篩選出的滸苔多糖降解菌株A1-6和S7對滸苔多糖的利用能力及對其他碳源的利用情況，用2216E液體培養(yǎng)基加上滸苔多糖及其他碳源測試菌株的生長曲線及碳源利用譜。除滸苔多糖外，測試的碳源有：葡萄糖、α-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖、D-半乳糖、蔗糖、木聚糖、糊精、可溶性淀粉及明膠。配制以上各種糖的儲備液，質(zhì)量濃度為20 g/L。所用糖溶液經(jīng)121℃、15 min高溫蒸汽滅菌后使用。取保存的A1-6和S7菌種，用2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3代活化。取15 mL無菌培養(yǎng)管，每管加入2216E培養(yǎng)基9 mL，待測糖儲備液1 mL（終質(zhì)量濃度為2 g/L），接種菌液1 mL。以不加糖儲備液的培養(yǎng)物作為對照。每組培養(yǎng)物各重復(fù)做3次。用丹麥Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)掃描計算培養(yǎng)物在600 nm下的OD值。
2結(jié)果分析
2.1采樣點滸苔綠潮的情況
2020年2月廣西北海爆發(fā)了滸苔綠潮。圖1（a）為廣西北海金海灣海域的綠藻，發(fā)現(xiàn)引發(fā)此次綠潮的綠藻主要有2種：絲狀的滸苔及片狀的滸苔。2021年7月，山東青島爆發(fā)了滸苔綠潮，圖1（b）為山東青島棧橋海域的綠藻，引發(fā)此次綠潮的綠藻主要為絲狀滸苔。
2.2北海及青島樣品分菌結(jié)果分析
北海樣品分離的微生物鑒定結(jié)果見表1。北海樣品中共分離到13種菌，其中海水樣品中有8種，絲狀滸苔附著菌分離到7種，片狀滸苔附著菌分離到4種（3個樣品中分離到的菌株存在部分重復(fù)，如交替單胞菌Alteromonas macleodii和Alteromonas oceani在3個樣品中都分離到；Polaribacter marinaquae和Maribacter dokdonensis分別在2個樣品中都有分離到）。共分離到3種黃桿菌：Polaribacter marinaquae、Maribacter dokdonensis、Cellulophaga lytica。其中，在海水及片狀滸苔上有分離到Polaribacter marinaquae（片狀滸苔上4次都分離到），絲狀滸苔上沒有分離到Polaribacter marinaquae；在片狀滸苔上和絲狀滸苔上都有分離到Maribacter dokdonensis（絲狀滸苔上2次分離到），海水中沒有分離到Maribacter dokdonensis；只在絲狀滸苔上分離到1株Cellulophaga lytica。
青島樣品分離的微生物鑒定結(jié)果見表2。青島樣品中共分離到22種菌，其中海水樣品中有10種，絲狀滸苔附著菌分離到12種，共分離到4種黃桿菌：Meridianimaribacter flavus、Tenacibaculum geojense、Tenacibaculum mesophilum和Algibacter lectus，4株都是在絲狀滸苔上分離到的，海水中沒有分離到。對比2個采樣點的分菌結(jié)果，只有Alteromonas confluentis在北海和青島樣品中都有分離到。其他菌株均不相同，包括2個樣點分離到的黃桿菌也不相同。
在菌株鑒定的基礎(chǔ)上，對重點分析的5株菌：菌株A1-6、S7、A2-2、aA1-7和aA1-9構(gòu)建了基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。從圖2可見，菌株A1-6與Alteromonas confluentis親緣關(guān)系最近，聚成一支，且屬于γ變形菌（γ-proteobacteria）。菌株S7、aA1-7、aA1-9、A2-2分別與Algibacter lectus、Cellulophaga lytica、Maribacter dokdonensis和Polaribacter marinaquae聚成一支，都隸屬于黃桿菌（Flavobateria）。
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