金黃色葡萄球菌PFGE分型、分布特征及藥敏情況（一）
近年來，隨著醫療相關的診療操作數量的上升，醫院獲得性感染已成為全球性問題。腦血管病患者多數伴大腦功能缺陷，意識出現障礙，生活不能自理，吞咽功能、咳嗽反射受損，嘔吐物或食物返流可導致肺部感染，繼發肺部感染是腦血管病患者死亡的重要原因。金黃色葡萄球菌作為臨床常見的機會致病菌，是引起醫院獲得性肺炎的主要革蘭陽性球菌。金黃色葡萄球菌可通過接觸、水和食物等在人與人、手與物、物與物之間傳播，特別是目前多重耐藥菌（MDRO）已經成為世界性公共衛生問題的形勢下，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在醫療環境中的傳播給患者帶來極大的感染風險，同時由于抗菌藥物選擇的局限性，也伴隨著治療困難和經濟損失。
近期，海軍軍醫大學第一附屬醫院腦血管外科病區在兩周內相繼從2例患者的痰中檢出金黃色葡萄球菌，樣本采集均為住院48 h后，其中1例為氣管切開術后，且此2例患者的床位相鄰。為了排除和預防環境因素引起的醫院感染，對該科室的醫務人員和環境進行重點部位調查采樣，分析該病區環境中金黃色葡萄球菌分布特征。
1材料與方法
1.1樣本來源
對腦血管外科某日在崗工作的醫師、護士、工勤人員的咽部、手、工作服和病員床單元物體表面、工作站物體表面進行采樣。
1.2方法
1.2.1采樣與培養使用浸濕生理鹽水或含中和劑的肉湯（青島海博生物技術有限公司）的棉拭子對醫護工勤人員的咽部、手、工作服、床單元物表、護士站物表進行采樣。咽拭子采用四區劃線直接涂抹接種哥倫比亞血、麥康凱和巧克力瓊脂平板（上海科瑪嘉微生物技術有限公司），用于條件致病菌培養。其余類型樣本各采集兩份，第一份采用四區劃線直接涂抹接種哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，用于篩選條件致病菌。第二份將棉拭子手接觸部分折斷后放入含復方中和劑的無菌培養基中，2 h內按照規范進行接種，用于菌落計數，按相關標準≤10 CFU/cm2為合格。兩種方法接種后的培養基放入（36±1）℃恒溫培養箱，24 h后對直接接種平板上的疑似致病菌進行純分之后鑒定，48 h后對菌落計數法的平板進行判讀。咽拭子采樣、分區劃線法接種和結果判讀參照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版），手、物表采樣和菌落計數法結果判讀參照相應規范。醫院醫用織物洗滌消毒技術規范WS/T508-2016僅對清洗后的工作服有微生物菌落數要求，對工作狀態下穿用的工作服未做要求和規范，故本研究對此類樣本僅計算菌落數，不做合格性判斷。
1.2.2菌株鑒定與藥敏試驗采用微生物質譜儀器（德國Bruker）對疑似致病菌進行鑒定，對分離出的金黃色葡萄球菌采用紙片擴散法進行甲氧西林（頭孢西丁紙片法，英國OXOID）藥敏試驗，參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）2020年M100文件判讀藥敏結果。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。
1.2.3脈沖場凝膠電泳（PFGE）將待測金黃色葡萄球菌接種于平板，35℃培養過夜，用bioMérieux DENSIMAT比濁儀調整細菌懸液濃度，使濁度為6.0～6.5麥氏濁度。加入1%Seakem Gold：1%SDS膠，混勻制備膠塊。使用含蛋白酶K的細胞裂解液（CLB）54℃消化3 h，純水清洗膠塊2次，TE（10 mmol/L Tris：1 mmol/L EDTA，pH值8.0）清洗膠塊4次，60 U SmaI（NEB公司）內切酶25℃酶切4～5 h。在CHEF-DRⅢ（Bio-Rad Laboratories公司）電泳儀中進行脈沖場電泳。電泳參數為4～40 s，19 h。電泳結束后，使用GelRed核酸染料染色，在讀膠儀中成像，PFGE圖像錄入BioNumerics軟件進行聚類分析。分子量標準為H9812經過XbaI酶切后的片段。
2結果
2.1樣本菌落數不合格情況和病原菌分布
2.1.1菌落數從醫務人員和物體表面環境中共采集菌落計數樣本88份，見表1。其中手12份，工作服12份，物體表面64份。手和床單元物表菌落數不合格率分別為66.7%（8/12）和13.7%（7/51），護士站物表菌落數不合格率為0。2位護工手的菌落數均較高，其中1位高達100.0 CFU/cm2，3位醫師手的菌落數分別為12.0、40.0、56.7 CFU/cm2，護士手的菌落數范圍為0～50.0 CFU/cm2，床單元和護士站物體表面菌落數范圍分別為0～30.0 CFU/cm2和0～9.6 CFU/cm2，工作服菌落數為0.8～29.4 CFU/cm2。床單元物表菌落數不合格的7份分別為：監護儀按鈕（1份）、氧飽和度探頭（3份）、床欄（2份）、床頭柜臺面（1份）。護士站物表菌落數最高的為ICU護士站桌面，為9.6 CFU/cm2。
表1腦血管外科病區環境樣本的微生物菌落數不合格情況
2.1.2病原菌分布金黃色葡萄球菌在醫務人員和工勤人員的咽拭子、手、工作服、地面、患者床單元物表均有檢出，總檢出率為17.8%（18/101），見表2。醫務人員咽拭子、手和工作服檢出率分別為7.7%（1/13）、25.0%（3/12）和33.3%（4/12），護士站和床單元物表檢出率分別為38.5%（5/13）和9.8%（5/51），具體分布為1名護士咽拭子、1名醫師手、2名護士手、3名護士工作服、1名護工工作服、護士站物體表面5處和床單元物體表面5處。此外，皮氏不動桿菌在氧飽和度探頭、呼吸機按鈕、地面和墻面多處中檢出，產氣克雷伯菌在隔簾上檢出，肺炎克雷伯菌、日勾維腸桿菌、停乳鏈球菌、鮑曼不動桿菌、解甘露醇羅爾斯頓菌在醫務人員的咽拭子中檢出。
表2腦血管外科病區環境樣本的病原菌檢出情況
2.2金黃色葡萄球菌藥敏試驗結果
從不同來源分離出的21株金黃色葡萄球菌對甲氧西林的藥物敏感性見圖1。其中，分離于護士站地面的菌株為MRSA，其余從環境中分離出的菌株均為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）。從該科室患者P1和P2痰中分離出的3株金黃色葡萄球菌（S7、S8和S9）均為MRSA。
圖1金黃色葡萄球菌PFGE聚類分析圖以及菌株藥敏情況
2.3金黃色葡萄球菌PFGE分型
PFGE結果顯示，21株金黃色葡萄球菌分為13個PT型：患者痰包含2個型別（PT05和PT06），咽拭子包含1個型別（PT02），手包含3個型別（PT04、PT09和PT12），工作服包含3個型別（PT01、PT04和PT11），見圖1。ICU護士站櫥柜把手和護工HW1工作服上檢出的金黃色葡萄球菌型別一致（PT01），且與護士N2咽拭子檢出的金黃色葡萄球菌型別（PT02）相似度高（89.7%）。護士N3的手和工作服上檢出的金黃色葡萄球菌型別一致（PT04），且與患者P1痰中兩次時間點檢出的金黃色葡萄球菌（S7和S8）型別（PT05）相似度高，為91.1%。患者P2痰中檢出金黃色葡萄球菌S9型別（PT06）與病區護士站地面金黃色葡萄球菌型別（PT07）高度相似（92.9%）。但2例患者檢出的菌株型別（PT05和PT06）差距較大。患者P4床頭柜和其床旁椅子上檢出的金黃色葡萄球菌型別一致（PT08）。ICU護士站鍵盤和文具與患者P3使用的監護儀按鈕上檢出的金黃色葡萄球菌型別一致（PT10）。患者P5床頭柜臺面、護士N5工作服、ICU護士N1工作服檢出的金黃色葡萄球菌型別一致（PT11）。
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