基于革蘭氏陽性菌生長曲線等指標(biāo)評價纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（一）
摘要：為有效預(yù)防、處理食品中的微生物污染，本研究以微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）為原材料，通過L-甲硫氨酸（L-methionine，L-Met）負(fù)載，制備得到了具有抗菌效果的L-Met改性MCC（M-MCC）。通過微觀形貌、元素組成分析等表征改性后M-MCC的形貌變化、元素變化以及穩(wěn)定性，證明了L-Met成功接枝。對M-MCC的體外抗氧化能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對2，2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基有良好的去除效果，當(dāng)M-MCC的質(zhì)量濃度為20 mg/mL時，對ABTS陽離子自由基的清除率達(dá)到97.47%。而后通過最小抑菌濃度以及細(xì)菌生長曲線對M-MCC抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的效果進(jìn)行研究。確定了M-MCC對L.monocytogenes和S.aureus等革蘭氏陽性菌有著較好的抑制效果，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為15 mg/mL和30 mg/mL。最后，以L.monocytogenes和S.aureus為指示菌，研究了M-MCC對指示菌細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞內(nèi)容物以及DNA含量等多個方面的影響。相關(guān)結(jié)果表明，M-MCC處理對L.monocytogenes和S.aureus的生長有顯著的抑制效果，到達(dá)對數(shù)生長期的時間相較無處理組有所推遲。相應(yīng)的胞外電導(dǎo)率、核酸和蛋白質(zhì)的含量都有著明顯的變化，且與處理時間密切相關(guān)。本研究表明M-MCC在抗菌應(yīng)用方面具有巨大潛力。
革蘭氏陽性菌是能被革蘭氏染色為深藍(lán)色或紫色的細(xì)菌，其細(xì)胞壁中含有大量的肽聚糖。由革蘭氏陽性菌引起的感染可能導(dǎo)致許多嚴(yán)重的疾病，包括敗血癥、菌血癥、肺炎和心內(nèi)膜炎等。其中單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中常見的革蘭氏陽性菌。L.monocytogenes在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實是L.monocytogenes的感染源。S.aureus感染引起中毒的食品種類較多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。L.monocytogenes每年導(dǎo)致全球約23 000例嚴(yán)重感染，易感人群的死亡率超過30%。2018年，歐盟共有2 549例侵入性L.monocytogenes確診病例，每10萬居民中有0.47例，1 469例確診病例中死亡率為15.6%，是所有食源性疾病中死亡率最高的。金黃色葡萄球菌是一種共生細(xì)菌，可在人類的皮膚、鼻子和腸黏膜上繁殖。無病征的工人可透過人手接觸或呼吸道分泌物污染食物，因而成為葡萄球菌導(dǎo)致食物中毒的源頭。這種腸道中毒是因進(jìn)食受產(chǎn)生腸毒素的金黃色葡萄球菌污染的食物而導(dǎo)致。細(xì)菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎、骨關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織感染以及器械相關(guān)感染是金黃色葡萄球菌引起的主要疾病。食源性疾病帶來的負(fù)面影響不僅局限于某個人或某一處地方，其會深入到生活的各個方面，食品的微生物污染問題也逐漸成為所有人共同關(guān)注的焦點。因此，如何快速有效地殺滅食品中的致病微生物，確保食品安全，對消費者及社會各方都具有十分重要的意義。食品中微生物的抑制和去除方法也成為許多研究者不斷研究的課題。
為提高食品包裝的抑菌能力，通常在包裝中添加抑菌材料。常用的抑菌材料可分為無機(jī)抑菌材料和有機(jī)抑菌材料。一些無機(jī)化合物具有一定的抗菌活性，如銀（Ag）、銅（Cu）、鋅（Zn）等以及相應(yīng)金屬氧化物。此外，納米顆粒和納米技術(shù)也多用于無機(jī)抗菌材料。無機(jī)抗菌材料最重要的特點是在熱等的條件下具有很好的穩(wěn)定性。同時，無機(jī)抑菌材料也存在抗霉菌活性弱的缺點，因此在工業(yè)應(yīng)用時通常會加大使用劑量。有機(jī)抗菌劑對某些生物分子具有特異性。這一特性使其在醫(yī)療、保健、食品包裝薄膜等領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛。有機(jī)抗菌劑又分為天然抗菌劑和合成抗菌劑兩大類。天然抗菌劑主要包括精油類、溶菌酶類、殼聚糖類、細(xì)菌素類和酚類。合成抑菌劑包括季銨鹽和其他活性物質(zhì)負(fù)載聚合物復(fù)合材料。目前，抗菌劑的發(fā)展方向除了探索開發(fā)天然抗菌劑外，更多的是將天然抗菌劑負(fù)載在聚合物材料上，從而在保留抑菌劑活性的條件下達(dá)到增強(qiáng)其機(jī)械性能的效果。近年來，由于纖維素獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，例如無毒環(huán)保、生物相融性好、可再生性強(qiáng)等特點，又具備比表面積大、納米結(jié)構(gòu)精細(xì)、力學(xué)強(qiáng)度良好和熱膨脹系數(shù)較低等特點，纖維素可作為一種理想的新型食品載體材料，被廣泛應(yīng)用于包括食品、造紙、生物材料和制藥行業(yè)的許多領(lǐng)域。
纖維素來源廣泛，年產(chǎn)量約為500億t。纖維素是由β-D-吡喃葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的線性高分子化合物，具有良好的親水性和化學(xué)修飾性，是自然界中最豐富的生物大分子材料，是最適合合成綠色產(chǎn)品的原料之一。近年來，纖維素基抗菌劑的研究逐漸成為抗菌研究的熱門。纖維素可以作為性能優(yōu)良的載體，運用不同的改性方法能夠使纖維素在具備較好抗菌效果的同時滿足差異化的需求。氨基酸是生物大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是一類同時含有堿性氨基和酸性羧基的兩性化合物，目前一共有22種氨基酸。按照人體能否自行合成，可將氨基酸分為必需氨基酸和非必需氨基酸。氨基酸的結(jié)構(gòu)基本類似，性質(zhì)的不同主要體現(xiàn)在R基的不同。甘氨酸的R基為—H，不具備立體異構(gòu)體，除甘氨酸外的所有氨基酸都具備立體異構(gòu)體，即存在D-型和L-型兩種構(gòu)型。氨基酸被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。氨基酸具有豐富的官能團(tuán)，且大部分氨基酸具有良好的水溶性，是纖維素改性的一個良好選擇對象。
一些研究如含有五倍子草提取物的高吸水性交聯(lián)羧甲基纖維素-聚乙二醇水凝膠（最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.24 mg/mL）和由聚己內(nèi)酯及醋酸纖維素制成、添加精油的同軸濕紡纖維（對S.aureus的MIC為2.06 mg/mL）雖然具備較低的MIC，但一般都用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為體外傷口敷料，難以運用在食品中。此外，這些材料的制備還存在著提取困難、合成復(fù)雜等問題。相較于其他材料，纖維素和氨基酸均為綠色無害的天然化合物，可以廣泛應(yīng)用于食品中，且合成原料便于獲取、成本較低，通過高碘酸鈉氧化接枝的合成途徑和條件也較為簡單。
本研究以食品中常見的L.monocytogenes和S.aureus兩種革蘭氏陽性菌為研究對象，以微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）為載體，L-甲硫氨酸（L-methionine，L-Met）為改性材料，設(shè)計開發(fā)一種纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）。通過L.monocytogenes和S.aureus生長曲線等指標(biāo)評價M-MCC的抑菌效果，通過測定M-MCC處理后細(xì)胞膜通透性等指標(biāo)以評價M-MCC對L.monocytogenes和S.aureus細(xì)胞膜的影響。
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