不同乙醇、乙酸、氯化鈉、濃度對小米醋發(fā)酵過程中醋酸菌生長曲線的影響（二）
1.2儀器與設(shè)備
DL-CJ-2 ND1超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;KG-SX-700立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海萊睿科學儀器有限公司;CX23光學顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司;HWS-250B電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司;XJ220A-SCS電子分析天平，上海天美天平儀器有限公司;LPH-A pH計，北京蘭杰柯科技有限公司;TU1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析儀器廠。
1.3實驗方法
1.3.1分離篩選
稱取10g醋醅或10mL醋樣，置于含有90mL無菌生理鹽水的三角瓶中，于30℃、150r/min充分振蕩30min。取1mL菌懸液裝入含有9mL無菌生理鹽水的試管中進行梯度稀釋。將各梯度(10?3、10??、10??、10??、10??)溶液吸取0.2mL涂布于分離培養(yǎng)基平板中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2~3d。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選出變色圈清晰且生長良好的單菌落進行2~3次分離純化。對符合條件的單菌落進行編號，挑選菌落形態(tài)一致的單菌落轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r將純化后的醋酸菌與30%甘油1:1(體積比)混合，存放在2mL的EP管中，保存于-80℃冰箱。
1.3.2形態(tài)特征
1.3.2.1菌落形態(tài)
將篩選菌株劃線于分離培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)48h后，觀察并記錄單菌落特征，包括透明度、顏色、表面情況、邊緣狀態(tài)以及外觀形狀。
1.3.2.2細胞形態(tài)
在分離純化后，將待觀察的菌株進行革蘭氏染色，放置在顯微鏡下，觀察菌體細胞形態(tài)和大小。
1.3.3生理生化實驗
生理生化實驗參照馮荊舒的方法。
1.3.4醋酸菌特性研究
1.3.4.1定性實驗
將斜面保存的菌種進行2次活化后，接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、150r/min的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72h后吸取10mL發(fā)酵培養(yǎng)液至離心管中，于5000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后取出5mL培養(yǎng)液置于小燒杯中。用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH7.0，然后滴加4~5滴50g/L的FeCl?溶液。若水浴加熱5min后出現(xiàn)紅褐色沉淀，則為醋酸菌。
1.3.4.2定量實驗
將斜面保藏菌株接種于50mL液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)36h后取菌液5mL接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)5d，產(chǎn)酸量測定參照GB12456-2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》方法。
1.3.5醋酸菌耐受性研究
將3%、5%、7%、9%、11%(體積分數(shù))的無水乙醇;2、4、6、8、10 g/L的氯化鈉;1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%(體積分數(shù))的乙酸接入到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，按10%(體積分數(shù))的接種量接入菌懸液，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每隔12h測定OD???值和產(chǎn)酸量，直至穩(wěn)定，每個菌種3次重復。
1.3.6生長曲線測定
將前期篩選出來的優(yōu)良菌株活化接種于液體培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔12h取一次樣，利用分光光度計測定其OD???值，同時將10??、10??、10??、10??的活化菌液吸取0.5mL均勻涂布至醋酸菌分離培養(yǎng)基平板，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，測定其活菌數(shù)，每個菌種3次重復。
1.3.7分子生物學鑒定
將篩選出來的優(yōu)良菌株進行測序，測序引物選用細菌16S rDNA的通用引物27F和1492R。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與目標菌株具有較大同源性的菌種做分析比較，采用MEGA11.0軟件進行多序列比對，并采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.4數(shù)據(jù)分析
本實驗采集3個平行樣，利用Excel、Orgrain軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準差”。
2結(jié)果與分析
圖1醋酸菌菌落及細胞形態(tài)
2.1菌落及細胞形態(tài)
從小米醋醋液、醋醅中分離得到24株具有典型醋酸菌特征的菌株。分別命名為SY01、SY02、SY03、RH04、RH05、SH06、YH07、YH08、GL09、GL10、GL11、XM12、XM13、GL14、SY15、GL16、GL17、GL18、GL19、XM20、SZ21、RH22、XM23、XM24。細胞形態(tài)主要為橢圓狀、短桿狀。典型醋酸菌落及細胞形態(tài)見圖1。
注:標尺為3mm;放大倍數(shù)100x。
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