鴿源大腸桿菌分離株對13種抗菌藥物耐藥現狀研究（一）
摘要:為調查廣東某肉鴿場大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)的流行情況以及耐藥性，該研究從肉鴿直腸內容物中分離大腸桿菌并進行鑒定，采用瓊脂稀釋法對分離得到的大腸桿菌進行藥敏試驗，通過PCR檢測分離株攜帶的耐藥基因。結果顯示，150份樣品共分離到120株大腸桿菌;藥敏試驗結果顯示分離株對環丙沙星、氨芐西林等13種抗菌藥物不同程度耐藥，其中74株大腸桿菌分離株存在多重耐藥情況;PCR檢測發現具有耐藥表型的菌株攜帶qnrS、blaTEM、blaCTX-M、blaVIM、aacC4和sul1 6種耐藥基因。上述結果表明，大腸桿菌分離株對13種抗菌藥物不同程度耐藥，存在多重耐藥現象，且攜帶多種耐藥基因。該研究可為廣東省鴿源大腸桿菌的流行情況、耐藥現狀及臨床合理用藥提供參考。
引言(Introduction)
近年來，隨著國民經濟水平的提高以及特禽飼養業的快速發展，肉鴿養殖煥發出蓬勃生機，養殖模式由散養向規模化、集約化方向發展。隨著養殖模式的轉變、養殖數量的增加、養殖密度的增大，再加上養殖環境的污染，這都促使大腸桿菌病成為危害肉鴿養殖業健康發展的重要細菌性傳染病之一，給養鴿業造成了嚴重的經濟損失。各種日齡的鴿均可感染大腸桿菌，主要經呼吸道、消化道引起鴿的腹瀉、敗血癥等局部或者全身性感染，以乳鴿、童鴿、青年鴿的發病較為嚴重，且死亡率高。
由于E.coli血清型眾多且不同血清型之間的交叉保護作用有限，實際生產中疫苗的使用效果不盡人意，因此抗菌藥物依然是目前防治鴿大腸桿菌病的主要措施，但隨著抗菌藥物的長期不合理使用，E.coli的耐藥性逐年增加，尤其對傳統抗菌藥物如氨芐西林、磺胺甲噁唑等的耐藥率逐年上升，并且出現多重耐藥菌株和超級耐藥菌株，極大提高了臨床大腸桿菌病的防控難度。E.coli又可以作為耐藥基因的儲藏庫，能以不同途徑將其攜帶的耐藥基因進行傳播，或隨食物鏈進入人體，嚴重威脅人類健康和公共衛生安全。
隨著不同種類抗菌藥物的廣泛使用，E.coli亦隨即對不同種類抗菌藥物產生出不同的耐藥機制。E.coli染色體攜帶耐藥突變基因gyrA和parC以及可水平轉移的qnrS基因可介導其對喹諾酮類藥物產生耐藥性。β-內酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)是當前E.coli耐藥性問題的最主要因素，可使β-內酰胺類藥物中的β-內酰胺環活性降低，使其產生耐藥，由質粒編碼的CTX-M型ESBLs不僅對青霉素類耐藥，而且對二、三、四代頭孢菌素類藥物的耐藥性也較高。E.coli對氨基糖苷類藥物耐藥最普遍的機制就是產生藥物功能基團滅活酶或稱修飾酶(核苷轉移酶ANT、乙酰轉移酶AAC、磷酸轉移酶APH)，可使氨基糖苷類藥物的一些結構被修飾、滅活從而產生耐藥性。磺胺類藥物耐藥性的產生主要是二氫葉酸合成酶的生成，使E.coli被抑制的程度下降而產生耐藥性，產生這種酶通常與Sul1、Sul2、Sul3這三種耐藥基因有關。腸桿菌對黏菌素的耐藥性可能是與染色體機制和(或)質粒攜帶的移動黏菌素抗性基因(mcr)有關，質粒介導耐黏菌素歸因于mcr基因，包括mcr-1到mcr-10。
本研究通過無菌方法采集新鮮病死鴿直腸內容物、分離細菌并進行大腸桿菌鑒定，采用瓊脂稀釋法對分離株進行藥敏試驗，通過PCR檢測分離株攜帶的常見重要耐藥基因，為規模化肉鴿養殖場大腸桿菌的流行情況、耐藥現狀及臨床合理用藥提供科學依據和數據支撐。
1材料與方法(Materials and Methods)
1.1主要材料
?病料:來源于廣東某規模化肉鴿場疑似細菌感染的新鮮病死鴿150只。
?主要試劑:
?LB肉湯培養基、LB瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。
?大腸桿菌標準株ATCC25922，由本實驗室保存并提供。
?抗菌藥物包括環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、氨芐西林(Ampicillin,AMP)、阿莫西林克拉維酸(Amoxicillin Clavulanic acid,AMC)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、亞胺培南(Imipenem,IPM)、阿米卡星(Amikacin,AMI)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、甲氧芐啶(Trimethoprim,TMP)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ)、黏菌素(Colistin,CL)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL)、磷霉素(Fosfomycin,FOS)等13種，均購自北京普博欣生物科技有限責任公司。
?2xFast Taq plus PCR Master、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、瓊脂糖、細菌基因組DNA提取試劑盒，均購自廣州市銳成生物科技有限公司。
?主要儀器:
?超凈工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司。
?BOD生化培養箱、恒溫震蕩培養箱，均購自廣州恒創實驗儀器有限公司。
?MALDI TOF MS質譜儀，購自日本島津公司。
?PCR擴增儀，購自蘇州東勝興業科學儀器有限公司。
?電泳儀，購自上海伯樂生命醫學產品有限公司。
?凝膠成像系統，購自廣州譽維生物科技儀器有限公司。
1.2細菌的分離與鑒定
?細菌的分離純化:無菌采集適量病死鴿直腸中段內容物，置于裝有1.0mL PBS的EP管中，震蕩搖勻靜置后取50μL上清液于麥康凱瓊脂平板上，涂布棒涂抹均勻，置37℃培養16-18h，觀察分離菌株的形態特征。然后用接種環挑選平板上單個紅色圓形菌落采用“Z”字連續劃線法再次接種到麥康凱瓊脂平板上培養直至純化。挑選純化后的單個菌落接種于LB肉湯中，37℃培養16-18h，獲得分離株純培養物，保存備用。
?分離株的鑒定:將獲得的分離株純培養物送至華南農業大學國家獸醫微生物耐藥性風險評估實驗室，采用MALDI TOF MS質譜儀進行菌株鑒定。
1.3耐藥表型檢測
以大腸桿菌標準株ATCC25922為質控菌株，采用美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦使用的瓊脂稀釋法測定大腸桿菌分離株的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，并依據歐盟藥敏試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)標準進行藥敏試驗結果判定。
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