鐵皮、疊鞘石斛提取物對(duì)沙門氏菌生長狀況、群體運(yùn)動(dòng)的影響——實(shí)驗(yàn)方法
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 石斛提取物制備
根據(jù)課題組前期建立的方法。將石斛和水按照料液比1∶10(g∶mL)進(jìn)行溶解,100 ℃沸水回流2 h。取上清液于離心管中,10 000 r/min高速離心15 min。取上清液,90 r/min、50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h。將所得物于干燥箱60 ℃烘干過夜。取烘干后物質(zhì)冷凍干燥12 h,將所得物質(zhì)置于干燥箱備用。
2.2 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)確定
制備菌懸液。挑取單菌落溶于生理鹽水中,倍比稀釋后至0.5麥?zhǔn)蠞舛葘?duì)照,選擇此稀釋度的菌懸液參與實(shí)驗(yàn)。制備實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基。將提取物溶解于LB肉湯培養(yǎng)基中,用倍比稀釋法制的質(zhì)量濃度梯度為32、16、8、4、2、1、0 mg/mL的含石斛提取物的液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定波長為600 nm的吸光度值,以吸光度值驟降的濃度作為提取物的MIC,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在亞抑菌濃度下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.3 石斛提取物對(duì)沙門氏菌生長狀況的影響
取活化的沙門氏菌,制備0.5個(gè)比濁單位的菌懸液,以1∶100的體積比接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,添加亞抑菌濃度梯度的石斛提取物,取等量滅菌生理鹽水加于等濃度梯度的含石斛提取物培養(yǎng)基中,作為消除色差組。置于全自動(dòng)生長儀中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h,每隔2 h測(cè)定波長為600 nm的吸光度值,用實(shí)驗(yàn)組吸光度減去消除色差組吸光度作為最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.4 石斛提取物對(duì)沙門氏菌群體運(yùn)動(dòng)的影響
向泳動(dòng)培養(yǎng)基中加入經(jīng)0.22 μm濾膜除菌的石斛提取物,使其終濃度為亞抑菌濃度梯度。充分混勻后傾倒平板,待平板冷卻后向平板中央滴加2 μL沙門氏菌菌液,無菌風(fēng)吹干,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量遷移圈直徑。比較遷移直徑的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.5 石斛提取物對(duì)沙門氏菌生物膜的影響
配制2種石斛提取物濃度梯度的液體培養(yǎng)基,在96孔板的A1～E1中每孔加入100 μL培養(yǎng)基,再向E1中加入100 μL 16 mg/mL的石斛提取物的培養(yǎng)基,混勻。在E1中吸取100 μL培養(yǎng)基加入D1中,混勻。梯度稀釋至B1,混勻后棄去100 μL培養(yǎng)基。向F1中加入100 μL 16 mg/mL的石斛提取物的液體培養(yǎng)基。每個(gè)濃度橫向重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。在A5～F8孔重復(fù)該步驟。在A1～F4孔中每孔加入10 μL OD600=0.1的菌液,A5～F8孔設(shè)置加生理鹽水作為對(duì)照組。將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,取出,棄去培養(yǎng)基,無菌水清洗3遍,甲醇固定,置于超凈工作臺(tái)中吹干。用結(jié)晶紫染液染色,靜置15 min,無菌水清洗3遍,吹干。加入乙酸溶液溶解10 min,并將液體轉(zhuǎn)移至另一96孔板中,測(cè)波長為590 nm的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.6 提取物的HPLC分析
采用HPLC技術(shù)對(duì)2種石斛提取物的成分進(jìn)行分析。色譜柱:Waters ACQUITYUPLCBEH C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,1.8 μm),流動(dòng)相:0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脫程序:0～6 min,5%～25% B;6～20 min,25%～40% B;20～25 min,40%～50% B,25～30 min;50%～5% B;流速0.60 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量1.0 μL;紫外分光檢測(cè)器條件360 nm。
2.7 分子對(duì)接模擬
通過分子對(duì)接驗(yàn)證活性單體與靶點(diǎn)的結(jié)合情況。本研究使用的分子對(duì)接程序AutoDock Vina (Vina 1.1.2)是一款采用半靈活對(duì)接方式運(yùn)行的程序,對(duì)接精度高達(dá)78%。LuxS蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為5V2W,從RCSB(https://www.pdb.org/)獲得。小分子的結(jié)構(gòu)文件來源于PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。將活性單體成分(mol.2格式)作為配體,LuxS蛋白(pdb格式)為小分子蛋白對(duì)接的受體。Autodock Tools 用于加氫,電荷檢查,分配原子類型為AD4類型,計(jì)算gasteiger電荷,構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的對(duì)接網(wǎng)格,并在Autodock Tools中指定配體中的可旋轉(zhuǎn)鍵,使用Discovery Studio 4.5軟件進(jìn)行作用力分析和可視化圖處理。
2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2022進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性分析,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”,組間差異比較采用單因素方差分析,采用t檢驗(yàn),P<0.05具有差異。
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