芽胞桿菌合成次級代謝產物Surfactin肽段分類地位及促生功能
Surfactin是芽胞桿菌合成的次級代謝產物，由7個α-氨基酸殘基的環(huán)短肽與鏈長為12-17個碳原子的β-羥基脂肪酸通過內酯鍵交聯(lián)組成的環(huán)狀物質。Surfactin家族典型的頭部氨基酸順序為：L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Leu6-L-Leu7。根據(jù)第7位氨基酸的類型，surfactin分為A（L-Leu）、B（L-Val）和C（L-Ile）三種類型，每種類型因脂肪酸肽鏈長度不同形成同系物。兩個帶負電荷的氨基酸殘基Glu和Asp為極性親水部位，其他氨基酸殘基和脂肪酸鏈組成疏水結構域，這種結構決定了surfactin具有兩親性和極高的表面活性。
濃度為40 mg/L的surfactin可以將水的表面張力從72 mN/m降低到27 mN/m。這優(yōu)越的表面活性和復雜的結構類型賦予surfactin多樣的生物活性，包括抗細菌、抗真菌、抗炎、溶栓、抗支原體、抗高膽固醇、抗病毒、抗癌和對胰島素抗性的改善等，使surfactin廣泛應用于醫(yī)藥、化工、食品、農業(yè)和環(huán)境治理等領域。Surfactin通過損傷病原菌細胞膜引起細胞膜裂解或滲透壓失衡、抑制病原菌繁殖、誘導植株系統(tǒng)抗性和促進生防菌株的定殖或生物膜形成等廣泛應用于植物促生和生物防治。
前人研究發(fā)現(xiàn)番茄細菌性潰瘍病生防菌株B.velezensis 1B-23和Bacillus spp.1D-12產生的脂肽C13-surfactins A、C14-surfactins A和C15-surfactins A均能抑制病原菌Clavibactermichigan sub（Cmm98-1）的生長。B.velezensis MS20菌株產生的surfactin具有抑制立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）菌絲生長的特性，用surfactin處理感染了R.solani的玉米植株，能有效降低玉米紋枯病的發(fā)病率，經(jīng)檢測抗性玉米植株細胞產生的防御酶含量相對提高，說明surfactin誘導了玉米植株的系統(tǒng)性抗性。從B.pumilus W-7菌株發(fā)酵液提取的surfactins和fengycin B，通過協(xié)同作用可有效降低馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率。
Fengycin B通過誘導菌絲變形、氧化損傷和線粒體功能障礙抑制P.infestans菌絲體菌絲生長；surfactin通過加強植株防御基因（pod、pal和cat）表達，提高了POD、PAL和CAT的酶活，誘導馬鈴薯的植株防御反應以抵抗晚疫病的發(fā)生。但是，野生菌surfactin產量低（一般不到1 g/L），雖然通過基因工程改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化，目前已報道產量達到了16.7 g/L，但是仍存在生產成本高和產量低的問題，是工業(yè)化生產和實際應用的技術瓶頸。
Surfactin產生菌包括枯草芽胞桿菌（B.subtilis）、貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）、解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）、暹羅芽胞桿菌（B.siamensis）、地衣芽胞桿菌（B.licheniformis）和短小芽胞桿菌（B.pumillus）等多種芽胞桿菌。不同菌株產生的surfactin類型不同、脂肪酸碳鏈長度也不同，故生物活性也有所差異。鑒于芽胞桿菌產surfactin類型和功能的特異性，以及目前實際工業(yè)化生產和應用的技術瓶頸，從環(huán)境中分離篩選優(yōu)良的產surfactin出發(fā)菌株，進而通過合成生物學技術和生產工藝優(yōu)化，以及深入解析surfactin的生物活性機制具有重要的理論意義和潛在的巨大實際經(jīng)濟效益。
本研究利用選擇性分離技術從植物根際篩選獲得surfactin高產菌株C5A-1，通過分子生物學技術確定了該菌株的分類地位，通過全基因組測序分析和MALDI-TOF質譜鑒定所產surfactin的類型，并采用多種植物檢測了該菌所產的surfactin的促生功能。研究結果豐富了脂肽產生菌資源，為通過合成生物學提高surfactin產量提供了優(yōu)良的底盤細胞工廠，為深入研究surfactin生物合成調控機制和生防促生機制提供了理論基礎。
Surfactin是芽胞桿菌屬多個種類產生的次級代謝活性物質。我們通過選擇性分離獲得surfactin產生菌C5A-1，利用16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析、全基因組平均核苷酸一致性分析和數(shù)字DNA-DNA雜交確定了C5A-1為芽胞桿菌屬貝萊斯種的一株新菌株。目前surfactin的工業(yè)化生產和實際應用的技術瓶頸是產量低和成本高。從環(huán)境中分離的野生菌的surfactin產量一般低于1 g/L，如模式貝萊斯芽胞桿菌FZB42為505 mg/L，生防貝萊斯芽胞桿菌BBC047和BBC025分別為633 mg/L和405 mg/L。我們從楊樹根際土中分離獲得的C5A-1產surfactin高達1 208.16 mg/L，為通過代謝工程改善surfactin產量提供了優(yōu)良的底盤菌株。Surfactin的結構一方面取決于7肽頭部氨基酸類型，另一方面取決于脂肪酸類型和C鏈長度，脂肪酸鏈的長度為C12-C17不等。對surfactin理化性質的研究發(fā)現(xiàn)，在同系物C12-C15中，表面活性隨著碳鏈長度的減小而降低（C12為32.2 mN/m），臨界膠束濃度值（CMC）從C12的0.35 mmol/L下降到C15的0.08 mmol/L，膠束聚集數(shù)的范圍從C12的4.7 nm升高到C15的5.7 nm。我們采用酸沉淀法制備C5A-1的發(fā)酵液粗提物，利用MALDI-TOF MS分析證實該菌主要產C14-和C15-surfactin A，為surfactin的功能研究和實際應用提供了結構基礎。
結論
Surfactin肽段的合成是由次級代謝基因簇編碼的非核糖體合成多肽（NRPS）完成的。NRPS是一種由重復模塊組成的多模塊巨型酶復合體，功能是將特定的氨基酸結合到肽骨架中。每個模塊可以分解為以下3個主要的結構域：腺苷酸（A）結構域、巰基化（T）結構域（也稱肽基載體蛋白，PCP）和縮合（C）結構域。A結構域負責識別、選擇并激活特定氨基酸，并通過與ATP的反應催化特定氨基酸轉化為氨基?；佘账?；活化的氨基酸以硫酯的形式共價結合到T結構域的柔性輔基4′-磷酸泛酰巰基乙胺基臂上，形成氨?；?S-載體復合物；C結構域負責催化新生肽和相鄰模塊攜帶的氨基酸之間形成肽鍵，并允許隨后延伸鏈移位到下一個模塊。部分模塊內部還催化修飾氨基酸的差向異構化（E）結構域，肽鏈延伸循環(huán)結束后，末端硫酯酶（TE）結構域負責釋放線性肽段，并催化肽段內部的環(huán)化。Surfactin的啟動模塊采用C-A-T結構，而非經(jīng)典的A-T結構，該模塊包含一個特殊的C-結構域，稱為C-起始（Cs）結構域，負責已活化脂肪酸與第一個氨基酸殘基連接，起始肽段的合成。我們利用Antismash分析C5A-1的次級代謝基因簇，預測發(fā)現(xiàn)surfactin的NRPS酶由srfA/lic操縱子，包含srfAA/licA、srfAB/licB、srfAC/licC和srfATE四個結構基因，預測會產生線性7肽（FA-L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Ley6-L-Leu7）；SrfAC的TE結構域會催化線性脂肽釋放，并催化Leu7與β-羥基脂肪酸的羥基之間形成內酯鍵環(huán)化短肽。深入分析基因簇內容也包含了輔助surfactin合成基因、調控基因hxlR，以及轉運相關基因等。我們對C5A-1的全基因組測序和次級代謝產物分析為基因工程改造法提高surfactin的產量提供了有利的遺傳信息。
由于具有親水的氨基酸頭部和疏水的脂肪酸鏈尾巴這一特殊的結構特征，surfactin具有極強的表面活性和多樣的生物活性，在化妝品、食品、醫(yī)藥、農林業(yè)及環(huán)境修復等領域具有巨大的應用潛力。不斷增長的人口對糧食的需求不斷增加，給農業(yè)和食品工業(yè)帶來了額外的負擔。化學農藥、殺菌劑、化肥和高育種作物品種通常用于提高作物生產力，然而，化學品的過度開發(fā)及其在環(huán)境中的持續(xù)存在對土壤、水和空氣產生了有害影響，從而擾亂了食物鏈和生態(tài)系統(tǒng)。農用化學品、農藥、金屬和碳氫化合物較低的水溶性和較高的疏水性使它們能夠附著在土壤顆粒上，從而在環(huán)境中繼續(xù)存在。化學農藥，如有機磷、有機氯和氨基甲酸酯，經(jīng)常用于保護農產品。通過surfactin或產生surfactin和降解農藥的微生物，可以將黏附在土壤顆粒上的疏水污染物溶解或解吸。同時，surfactin對多種植物病原體具有廣譜抗菌活性而被廣泛研究。最新研究表明采用葉面噴施surfactin方式處理小白菜，可以顯著提高其株高、根長以及葉綠素含量，初步揭示了surfactin作為植物生長刺激劑的潛在應用價值。我們利用盆栽實驗檢測了C5A-1發(fā)酵液surfactin提取物對毛白楊組培苗、玉米和大豆幼苗生長的調控功能，結果顯示，不同濃度的surfactin對3種植物幼苗均具有顯著的促生功能，該研究結果不但為C5A-1作為菌劑產品或其產物surfactin作為植物生長刺激劑應用于農林業(yè)提供了理論基礎，同時為深入解析植物-微生物互作機制的解析提供新視角。
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