牦牛源短小芽孢桿菌生長曲線測定及藥敏試驗、體外抑菌結果解讀（一）
[目的]本試驗旨在研究一株牦牛源短小芽孢桿菌(命名:TS1)的分離鑒定、抗逆性、對常用抗菌藥物的耐藥性以及對常見致病菌的抑菌活性，初步探索其作為益生菌添加劑在畜牧養殖中應用的可行性。[方法]對健康牦牛新鮮糞便進行100℃水浴處理10 min以篩選具有抗逆性的芽胞桿菌，進行形態學、生理生化特征及16S rRNA序列分析鑒定，通過測量生長曲線、耐酸、耐膽鹽試驗、藥敏試驗及抑菌試驗等方法對其生物學特性進行研究，通過全基因測序分析其可能產生抗菌物質的類型。[結果]TS1為短小芽胞桿菌且具有耐酸、耐膽鹽生長特性;TS1對于12種常見的抗菌藥物敏感，且對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌具有抑菌作用。測序分析顯示該菌株可編碼與Amylocyclicin同源性達48.90%的一種新型抗菌肽，進而發揮其抗菌活性。[結論]短小芽胞桿菌TS1有一定的抗逆性和潛在的益生能力及廣譜抗菌效果，并且在畜禽腸道微生物系統中對抗生素耐藥性傳遞的風險較低，適合作為益生菌添加劑類抗生素替代產品。
引言
抗菌藥物是人類和畜禽防治細菌感染的重要手段。隨著抗菌藥物的不當使用或濫用，細菌對常用抗菌藥物的耐藥性日趨嚴重。因此，“飼料端禁抗、養殖端減抗、限抗”已成為全球共識。歐盟自2006年1月開始不允許抗菌藥物作為飼料添加劑使用，中國自2020年開始也禁止在畜禽養殖過程中作為飼料添加劑使用抗生素。在“禁抗限抗”的大背景下，急需開發抗生素替代產品用于畜禽臨床生產實踐。目前益生菌是應用較廣的替代產品之一，益生菌添加劑不僅可以提高動物生長速度，還可以維持腸道菌群平衡，并且可以通過調控畜禽腸道菌群維持腸道上皮的穩態，從而促進畜禽腸道健康。益生菌本身及其代謝產物又具有廣譜抗菌作用，因此篩選不同動物來源的益生菌是“減抗限抗”大背景下抗生素替代品開發的有效方式。
農業部2013年公布了飼料添加劑的品種目錄，共有13種類別，其中包括短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)。短小芽胞桿菌被廣泛應用的優勢:1)易保存、抗逆性好，分離、培養和保藏的條件簡單，對工業化工生產技術要求低，能夠在腸胃中保持穩定作用并且保持較高活性;其芽胞對外在的惡劣環境(如熱、紫外線、電離輻射和低pH等)有較強抵抗作用;2)當攝入足夠量時能夠預防或改善腹瀉，緩解不耐乳糖癥狀，預防生殖系統感染，增強畜禽免疫力，促進腸道消化系統健康，降低血清膽固醇，幫助吸收營養成分與促進畜禽生長等。綜上，短小芽胞桿菌具有易保存、活性成分高等優勢，值得大量推廣和應用。
本試驗從健康牦牛糞便中分離到1株具有益生潛力的短小芽胞桿菌，對其形態學、生理生化、耐酸、耐膽鹽、對常用抗菌藥物的敏感性及對常見病原菌的抑菌活性等進行研究，旨在評價其用于制備益生菌添加劑的可行性，為動物來源的益生芽胞桿菌的開發利用提供理論基礎。
1材料與方法
1.1樣品來源
于甘肅將軍山丹軍馬場無菌采集健康牦牛糞便，一部分用于室溫分離短小芽胞桿菌，剩余樣品-80℃保存。
1.2主要試劑
試驗所需主要試劑為LB培養基(青島海博生物技術有限公司)、LB液體培養基(青島海博生物技術有限公司)、Landy培養基(上海瑞楚生物科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、革蘭氏染色液(南京建成生物工程研究所)、鹽酸(優級純，HCl含量36%～38%)、牛膽鹽(上海源葉生物科技有限公司，膽酸含量大于等于60%)、細菌16S rRNA通用引物及PCR 2x Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、生化鑒定管(廣州環凱微生物科技有限公司)、藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司和北京索萊寶科技有限公司)等。
1.3菌株的分離與純化
取1 g左右牛糞樣品至裝有5 mL無菌生理鹽水的玻璃試管中，用封口膜封住管口于沸水中煮沸10 min;取煮沸后的100μL上清液至裝有5 mL LB液體培養基的EP管中，放入搖床，37℃、160～180 r·min-1振蕩培養16～18 h;取100μL菌液加入5 mL液體培養基中再次振蕩培養16 h;蘸取菌液在LB固體培養基中劃線，于37℃恒溫箱中倒置培養12～18 h，挑取單菌落接種LB固體培養基于37℃恒溫箱培養12～18 h，再次挑取單菌落至5 mL LB液體培養基中振蕩培養16～18 h，得到純化菌液。
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