量化人類腸道菌種對(duì)艱難梭菌長(zhǎng)期生長(zhǎng)的影響（五）
根據(jù)推斷的gLV參數(shù)，兩種交互網(wǎng)絡(luò)都顯示出頻繁的負(fù)交互作用，符合之前的研究發(fā)現(xiàn)(圖4B和4C)。與祖先株(18%)相比，進(jìn)化株(25%)存在更多的正交互作用。值得注意的是，15%的推斷交互作用具有不一致的符號(hào)。祖先株和進(jìn)化株艱難梭菌株之間的種間交互系數(shù)顯示出中度的相關(guān)性(皮爾遜R=0.59，p=1.8E?06；圖4D和S12D)。相比之下，作為參考，不同遺傳背景的艱難梭菌株之間種間交互作用的差異不頻繁(所有艱難梭菌株對(duì)之間的皮爾遜R值為0.81–0.89，p=3.4E?14至7.6E?20)。這一發(fā)現(xiàn)突顯了艱難梭菌代謝基因中兩個(gè)關(guān)鍵單點(diǎn)突變對(duì)人體腸道微生物種間交互作用的重大影響。例如，CS和CH對(duì)祖先株的抑制作用顯著大于進(jìn)化株。由于CS和CH在我們的培養(yǎng)基中顯著消耗了脯氨酸(圖S6B)，因此與艱難梭菌代謝生態(tài)位的改變相比，祖先株可能與CS和CH之間的資源競(jìng)爭(zhēng)程度高于進(jìn)化株。
艱難梭菌的演化適應(yīng)間接影響了其他群體成員之間的配對(duì)交互作用(圖4B–4D)，這表明網(wǎng)絡(luò)中可能存在更高階交互作用(HOI)。為了直接捕捉潛在的HOI，我們使用了一種修改的gLV模型，其中包含群體成員之間的配對(duì)和第三階交互作用(gLV-HOI)進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合(圖S12E、S13C和S13D；STAR方法)。通過(guò)20倍交叉驗(yàn)證，gLV-HOI顯示出高預(yù)測(cè)性能(皮爾遜R=0.93–0.98，p<10E?05)，但未能在基于相關(guān)系數(shù)z檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)gLV模型中獲得更優(yōu)表現(xiàn)(表S12；圖S12C)。這表明群落動(dòng)態(tài)主要由二階交互作用驅(qū)動(dòng)。gLV-HOI的參數(shù)數(shù)量大于標(biāo)準(zhǔn)gLV模型，因此使用有限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)估計(jì)更加挑戰(zhàn)。為了進(jìn)一步研究HOI項(xiàng)的貢獻(xiàn)，我們使用套索回歸(STAR方法)評(píng)估了gLV-HOI的預(yù)測(cè)性能。套索回歸使用L1正則化，這會(huì)懲罰參數(shù)估計(jì)的絕對(duì)值總和(L1范數(shù))，促進(jìn)模型的稀疏性。相比之下，貝葉斯推斷中的正態(tài)先驗(yàn)引入L2正則化，懲罰參數(shù)與先驗(yàn)均值之間的平方差，從而實(shí)現(xiàn)參數(shù)估計(jì)的平滑收縮，而不是驅(qū)動(dòng)參數(shù)趨于零。在不顯著改變預(yù)測(cè)性能的情況下，正則化系數(shù)的最大值迫使所有HOI參數(shù)為零(圖S14A–S14D)。這意味著在該數(shù)據(jù)集上，gLV模型的預(yù)測(cè)性能不會(huì)因HOI項(xiàng)而改善。然而，我們不能排除gLV-HOI在捕捉社區(qū)潛在HOI交互作用方面不夠靈活的可能性。總之，艱難梭菌關(guān)鍵的演化適應(yīng)導(dǎo)致其代謝生態(tài)位的顯著改變，給人體腸道群落配對(duì)交互作用的推斷帶來(lái)了重大改動(dòng)(圖4B–4D)。
演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株在哺乳動(dòng)物腸道中減輕了疾病嚴(yán)重程度
氨基酸如脯氨酸已被證明能夠調(diào)節(jié)艱難梭菌毒素的體外生成，并影響哺乳動(dòng)物腸道的定植。為了確定艱難梭菌的關(guān)鍵演化適應(yīng)是否會(huì)改變毒素的生成，我們通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)在培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行了毒素表達(dá)分析。演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株顯示出顯著較低的毒素濃度和產(chǎn)量(濃度與OD600之比)，相比于祖先菌株，在多種氨基酸濃度下均如此(Figures S15A和S15B)。
為了研究演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株是否影響疾病的嚴(yán)重程度，我們利用小鼠模型，將演化適應(yīng)的或祖先的艱難梭菌菌株通過(guò)口服灌胃引入無(wú)菌小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)中部分小鼠沒(méi)有人體腸道菌群（見圖5A）。具體而言，小鼠分別通過(guò)口服灌胃接種單一菌群（PV），另一部分小鼠則接種由七種人體腸道菌群組成的菌群（CS,CH,DP,BT,PV,BU,CA），這些菌群在我們的長(zhǎng)期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和菌群特性分析中均有應(yīng)用（見圖1和4）。這些菌群在挑戰(zhàn)前的8天被引入，旨在促進(jìn)小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和菌群定植。在單獨(dú)挑戰(zhàn)艱難梭菌的小鼠組和帶有七種菌群的小鼠組中，相較于祖先菌株，演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株表現(xiàn)出顯著較低的豐度和毒素濃度。這種艱難梭菌的定殖減少可能導(dǎo)致毒素生成較少，因?yàn)槎舅禺a(chǎn)量（毒素量除以艱難梭菌菌落形成單位[colony-forming unit,CFU]）在兩個(gè)組之間相似（見圖S15D）。這種與體外實(shí)驗(yàn)中的毒素產(chǎn)量不一致（見圖S15B）的現(xiàn)象表明，毒素在體內(nèi)和體外的調(diào)控機(jī)制存在差異。為了更全面地探討祖先或演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株的影響，我們聚合了所有處理組的數(shù)據(jù)，分析微生物群落組成的變化（見圖S15C）。在所有微生物群落條件下，挑戰(zhàn)演化適應(yīng)的艱難梭菌的小鼠顯示出更高的存活率，并顯著低于挑戰(zhàn)祖先菌株的小鼠，相對(duì)體重減輕盡管所有小鼠在最初幾天體重均顯示出下降趨勢(shì)（見圖5B–5D和S15C）。
圖5|演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株緩解了小鼠的疾病嚴(yán)重性
(A)小鼠實(shí)驗(yàn)示意圖。小鼠在引入原始或演化適應(yīng)的艱難梭菌菌株前，分別被挑戰(zhàn)于沒(méi)有任何腸道菌群干預(yù)(僅艱難梭菌組)或通過(guò)PV菌株或7種腸道菌群組合(CS、CH、DP、BT、PV、BU和CA)進(jìn)行口服灌胃8天。
(B–D)小鼠在僅接受艱難梭菌(n=4)(B)、PV與艱難梭菌(n=4)(C)以及7種腸道菌群與艱難梭菌(n=4)(D)口服灌胃后，存活百分比、初始體重百分比、艱難梭菌豐度以及艱難梭菌毒素濃度(每mg盲腸內(nèi)容物)。在存活率上，log-rank檢驗(yàn)顯示了顯著的p值。在初始體重百分比上，線條表示該組所有小鼠的平均值。體重下降至75%以下的小鼠會(huì)被淘汰。在艱難梭菌豐度方面，通過(guò)CFU計(jì)數(shù)法確定值，該方法使用了盲腸內(nèi)容(存活)和盲腸內(nèi)容(死亡)進(jìn)行艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基的檢測(cè)。在盲腸內(nèi)容中的艱難梭菌毒素濃度方面，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。由于在多個(gè)治療組中，小鼠在第3天死亡，因此在第4天之后的數(shù)據(jù)點(diǎn)比總的實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)量少。因此，體重(%)和艱難梭菌豐度的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)僅在數(shù)據(jù)完整的第1到第3天進(jìn)行。對(duì)于體重(%)、艱難梭菌豐度和艱難梭菌毒素濃度的圖示，使用兩側(cè)的未配對(duì)t檢驗(yàn)顯示了顯著的p值。部分圖表由Biorender生成。
PV單菌群顯著降低了祖先艱難梭菌菌株的毒素濃度，使其與演化菌株達(dá)到相似水平（見圖5B、5C和S15E）。同時(shí)，PV顯著增加了演化菌株艱難梭菌菌株在某些時(shí)間點(diǎn)的定殖（見圖S15F），導(dǎo)致祖先菌株和演化菌株的艱難梭菌菌株在定殖方面達(dá)到相似水平（見圖5B和5C）。根據(jù)16S rRNA基因測(cè)序，PV在挑戰(zhàn)演化菌株的小鼠中相對(duì)豐度較高，而與祖先菌株相比（～77%對(duì)60%，7天后）（見圖S15G）。由于祖先菌株和演化菌株的絕對(duì)豐度在CFU計(jì)數(shù)法下相似（見圖5C），這一結(jié)果表明，PV在攜帶演化菌株的小鼠中的豐度高于攜帶祖先菌株的小鼠。因此，這些數(shù)據(jù)表明，PV和艱難梭菌菌株之間存在雙向互動(dòng)，影響小鼠腸道中的定殖能力和毒素生產(chǎn)。
在口服七種腸道菌群的小鼠中，存活率顯著低于僅攜帶艱難梭菌和PV單菌群的小鼠組（見圖5D）。這表明，七種腸道菌群顯著增加了艱難梭菌的疾病嚴(yán)重性。挑戰(zhàn)后第三天，在攜帶七種腸道菌群的小鼠中的祖先艱難梭菌菌株豐度顯著高于其他組（p值=0.02）（見圖5B–5D）。PV在攜帶祖先或演化菌株的小鼠中顯示出最高的相對(duì)豐度（～50%，接種幾天后，見圖S15H）。由于PV單菌群定殖未顯著改變疾病嚴(yán)重性，因此攜帶七種腸道菌群的小鼠相比其他組觀察到的疾病嚴(yán)重性增加可能是由其他菌群的存在、PV與艱難梭菌的交互作用變化或宿主-微生物交互作用導(dǎo)致的。總之，在所有條件下，與祖先菌株相比，演化菌株艱難梭菌菌株在小鼠腸道中顯示出顯著降低的定殖能力和疾病的嚴(yán)重性（見圖5B–5D和S15C）。
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