家兔肺支氣管敗血波氏桿菌生長曲線測定及耐藥性研究（二）
1.2.2 分離株生長曲線的繪制
挑取分離株單個菌落,接種于 5% 血清 TSB 固體培養基上,連續接種兩次。挑取 TSB 培養基上的單菌落接種到 10 mL 的 LB 液體培養基中,180 r/min,37 ℃過夜培養后按 1% 比例接種到 3 個 100 mL 的 LB 液體培養基中,于 37 ℃、220 r/min 恒溫搖床中振蕩培養,持續檢測 16 h,每個時間點重復檢測 3 次,取平均數。以培養時間為 X 軸、OD600 值為縱軸,繪制分離株的生長曲線。
1.2.3 分離株對小鼠半數致死量(LD50)測定
將 SPF 級 KM 小鼠隨機分成 6 組,6 只/組,雌雄各半,1~5 組為試驗組,6 組為對照組。試驗組小鼠腹腔注射 PBS 重懸菌液 0.3 mL,對照組注射等量的無菌 PBS。注射菌量分別為 1.02×109、3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105 CFU。然后將小鼠放回原籠中按之前飼養方式繼續飼養,觀察小鼠的生長情況并記錄結果。應用 SPSS 軟件對各組注射菌量、動物數、死亡數進行數據分析,并計算半數致死量(LD50)。
1.2.4 分離株藥敏試驗
采用 K-B 紙片擴散法進行分離株的藥敏試驗。取 180 r/min、37 ℃過夜培養的菌液 1 mL,調整菌液濃度至 0.5 麥氏濁度,每個 MH 培養基均勻涂布 100 μL 菌液后貼上藥敏紙片,37 ℃培養 20 h 后測定抑菌圈直徑,判定結果。
1.2.5 超廣譜 β-內酰酶耐藥基因檢測
用細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取分離株的 DNA,根據 NCBI 上公布的序列設計 bla-OXA、bla-TEM、bla-SHV、bla-CTX 的 PCR 引物(見表 1),檢測該菌株的耐藥基因。反應體系(20 μL):2× Taq PCR Master 10 μL,上下游引物各 1 μL,DNA 模板 1 μL,ddH2O 補足反應體系 20 μL。反應程序:95 ℃預變性 3 min;95 ℃變性 30 s,57 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 8 s,共進行 35 個循環;72 ℃額外延伸 5 min。PCR 擴增的條帶用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
表 1 引物及序列
基因名稱:16S rDNA
引物序列(5'→3'):F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT
片段長度(bp):1540
退火溫度(℃):53
基因名稱:bla-OXA
引物序列(5'→3'):F:GTGAAGCGTGTTGGTTAT; R:AGCCTACTTGTGGGTCTA
片段長度(bp):274
退火溫度(℃):53
基因名稱:bla-TEM
引物序列(5'→3'):F:TGAATGAAGCCATACCAA; R:AGATAACTACGATACGGGAG
片段長度(bp):279
退火溫度(℃):53
基因名稱:bla-SHV
引物序列(5'→3'):F:GACCGCTGGGAAACGGAACT; R:CCCGCAGATAAATCACCACAAT
片段長度(bp):307
退火溫度(℃):57
基因名稱:bla-CTX
引物序列(5'→3'):F:GTTGTTATTTCGTATCTTCCAG; R:ATTCGGTTCGCTTTCACT
片段長度(bp):311
退火溫度(℃):53
相關新聞推薦
1、藜麥和藍靛果酵母菌株篩選、培養、計數及混菌液態發酵工藝優化（一）
3、?微生物生長曲線分析系統研究復雜鹽度下單核細胞增生李斯特菌的生長速度