O 型口蹄疫病毒 3D 突變體重組 FMDV 的鑒定及生長曲線的測定（二）
1.4 重組病毒的拯救
測序正確的全長質粒 rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 各取 2.5 μg 與 5 μL Lip3000 混合后，轉染生長至 60％～90％的單層 BHK21 細胞中（步驟見試劑盒說明），同時設置正常細胞作為對照。 轉染完成后，置 37 ℃、50 mL/L CO2 恒溫培養箱繼續培養 48～72 h，每日觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE）情況，約 80％～90％細胞出現顯著 CPE 時收獲樣品，經－80 ℃冰箱反復凍融 2～3 次后，在 BHK21 細胞上連續傳 10 代，置－80 ℃冰箱保存病毒備用。
1.5 重組病毒的鑒定
將出現明顯 CPE 的重組病毒上清經反復凍融后，用 Trizol 裂解法提取總 RNA，經反轉錄酶反轉錄后，用引物 FMDV-MA-mutant-F：cctgaagctcatggagaagag，FMDV-MA-mutant-R：gcaggtaaagtgatctgtagc 擴增目的片段，回收后送擎科生物科技股份有限公司進行測序，以鑒定重組病毒的正確性。
1.6 重組病毒的生物學特性分析
1.6.1 病毒的傳代和突變穩定性檢測 鑒定正確的重組病毒按 5％接種量在 BHK21 細胞上連續傳至第 10 代，觀察記錄每代出現 CPE 的時間，將第 8 代和第 10 代病毒用 Trizol 裂解法提取總 RNA，用引物 FMDV-MA-mutant-F/FMDV-MA-mutant-R 進行 RT-PCR 擴增片段基因，檢測確保重組病毒在傳代過程中氨基酸能穩定突變。
1.6.2 一步生長曲線的繪制
將單層 BHK21 細胞分別接種 0.1 倍體積的第 10 代 rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 病毒液，吸附 1 h 后，棄去病毒液，換成新鮮培養基后，在不同時間點取樣，用于測定病毒滴度。 根據測定的病毒滴度結果來繪制病毒一步生長曲線。
1.6.3 乳鼠感染試驗
1.6.3.1 乳鼠存活率試驗 將在 BHK21 細胞上傳代穩定的重組毒用 PBS 緩沖液進行 1 ∶ 1 000 稀釋，經頸背部皮下注射 2～4 日齡乳鼠，rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 各注射 10 只，接種量為 50 μL／只，同時設置空白對照組。 連續觀察 8 d，記錄乳鼠死亡情況，根據致死情況繪制存活率圖。
1.6.3.2 病毒在肝中的復制情況 同樣使用在 BHK21 細胞上傳代穩定的重組病毒經 PBS 緩沖液 1 ∶ 1 000 稀釋后，經頸背部皮下注射 2～4 日齡乳鼠，rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 各注射 7 只，接種量為 50 μL/ 只。 連續觀察 7 d，中途死亡的乳鼠收集肝。 當到達第 7 天乳鼠狀態較好，則全部安樂死并收集肝。 將肝分成 2 份，進行病毒載量和組織病理分析。 1 份研磨后提取組織 RNA，用 RT-qPCR 方法定量肝中的病毒 RNA 量，另 1 份交由武漢賽維爾生物科技有限公司進行組織病理分析。
2 結果
2.1 表達 O 型口蹄疫 3D 蛋白的重組 FMDV 質粒的構建與鑒定
根據相關研究，筆者設計了 FMDV 的 3D 蛋白第 403 位甲硫氨酸突變成丙氨酸的完整 3D 蛋白，并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 構建策略見圖 1。
圖 1 O 型 FMDV 3D 蛋白中 M403 位點突變的全長 cDNA感染性克隆構建策略
2.2 含突變氨基酸全長質粒的構建
合成的質粒使用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ酶切出目的片段（3 172 bp）與載體（2 192 bp）（圖 2）。 將目的片段連接到目標載體（pcDNA3.1）上，測序結果顯示，已成功構建了包含突變氨基酸的全長質粒。
圖 2 FMDV 感染性克隆 pcDNA3.1 的構建
2.3 轉染和病毒拯救
單層 BHK21 細胞在 6 孔板中生長至 60％～90％時用于轉染，將質粒 pFMDV-3D-M403A-O 和 pFMDV-WT-O 轉染至 BHK21 細胞，置 CO2 培養箱中 37 ℃繼續培養 48 h 后，細胞出現顯著的 CPE，表現為細胞變圓并脫落，成單個或葡萄狀分布，但接種 rFMDV-M403A-O 質粒的細胞出現 CPE 時間較晚，而對照細胞形態完好，輪廓清晰。收取病毒，經－80 ℃冰箱反復凍融 3 次，繼續在 BHK21 細胞上傳代，直至出現 CPE 的時間縮短，病變更加典型（圖 3）。
圖 3 突變毒株 rFMDV-M403A 和親本毒株 rFMDV-WT 在 BHK21 細胞上的 CPE 分析
2.4 重組 FMDV 的鑒定
為了鑒定重組病毒的基因組序列正確，收集傳至第 8 代和第 12 代的重組病毒 rFMDV-M403A，用 Trizol 法從轉染的 BHK21 細胞中提取總 RNA，設計特異性引物，通過 RT-PCR 分別擴增含有第 403 位氨基酸的基因片段。 測序結果（圖 4）顯示，拯救的重組病毒的 3D 蛋白第 403 位甲硫氨酸成功突變成丙氨酸，且能夠穩定遺傳。
圖 4 rFMDV-M403A 毒株與親本毒株 rFMDV-WT 的部分鑒定結果
A：第 12 代 rFMDV-M403A 的部分基因序列；B：第 12 代親本毒株 rFMDV-WT 的部分基因序列。
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