?梅花鹿源A型產氣莢膜梭菌的分離鑒定、測序、毒素型、生化、耐藥性分析（一）
摘要:產氣莢膜梭菌(Clostridium.perfringens)是危害動物養殖業的重要病原，養鹿業深受其害。本研究從臨床患鹿腸內容物分離到一株C.perfringens菌株，運用16SrRNA基因序列比對、毒素型PCR及生化等方法進行菌株鑒定，并開展耐藥性分析;通過腹腔注射對小鼠進行攻毒，記錄其發病、死亡情況和組織病理學變化，建立小鼠感染模型。結果表明，分離株鑒定為A型C.perfringens，符合產氣莢膜梭菌生化特征，對阿米卡星、多黏菌素B、鏈霉素、卡那霉素、克林霉素、復方新諾明幾種抗生素表現出耐藥特征。菌液攻毒小鼠精神萎靡，被毛凌亂，扎堆不動，剖檢可見肝臟、脾臟腫大，腸壁變薄，小腸內有黃色內容物。該菌株半數致死量為7.99x107CFU·mL1。組織切片可見各組織器官充血、出血，炎性細胞浸潤，小腸腸絨毛部分斷裂脫落，結構不完整。本研究結果將為臨床鹿梭菌防治提供指導，為C.perfringens鹿用疫苗研制奠定基礎。
產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)又稱魏氏梭菌，廣泛存在于土壤、糞便和正常人畜腸道中，是一種條件致病菌，當環境條件發生變化或自身免疫降低時可致使感染鹿發病，表現為食欲減退或廢絕，精神萎靡，鼻鏡干燥，口流涎，反芻芻停止，腹圍增大，體溫升高，運動失調，后肢麻痹，昏迷倒地等，嚴重時死亡。
鹿產品有極高的商業價值，其中鹿茸滋補功效顯著，能夠改善睡眠、緩解疲勞，其價格每克在50~200元不等。除鹿茸外，鹿肉、鹿血、鹿胎、鹿皮、鹿筋和鹿鞭等也均是重要的鹿產品。近年來，鹿養殖過程中頻繁出現產氣莢膜梭菌感染的現象，該疾病發病急，死亡率高，造成了極大的經濟損失。因此，了解鹿感染產氣莢膜梭菌的主要分型和生長特性，明晰該類菌株的耐藥性和致病性，對于進一步研究如何有效預防該類菌株的感染和相關疫苗的研制有重要意義。
本研究從臨床死亡梅花鹿腸內容物中分離到一株C.perfringens，進行了16S RNA測序、毒素型、生化、耐藥性等分析，為臨床合理用藥提供指導，同時建立了小鼠感染模型，為鹿源C.perfringens的疫苗研究提供基礎。
1材料與方法
1.1發病情況
2023年3月份吉林省吉林市某梅花鹿養殖場發生大批鹿死亡，主要癥狀包括精神沉郁、腹瀉、流涎、腹圍增大、糞便帶血。剖檢可見腸黏膜出血，腸系膜淋巴結腫大，肝臟和腎臟腫大。
1.2主要試劑和儀器
胰胨胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基TSC、梭菌增菌培養基RCM、TL-2000 DNA Maker均購自博奧龍生物科技有限公司;7%羊血瓊脂基礎購自青島海博生物技術有限公司;2xMagic Green Taq Super Mix購自TOLOBIO公司;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;革蘭染色試劑、微量生化反應管均購自比克曼生物科技有限公司;厭氧產氣袋購自日本三菱化學株式會社;產氣莢膜梭菌a毒素(CPA)酶聯免疫吸附測定試劑盒檢購自上海仁捷生物科技有限公司。
恒溫搖床HT-2102XS購自上海赫田科學儀器有限公司;分光光度計YJ16202208007購自上海佑科儀表有限公司;高速離心機購自Thermo公司;基因擴增儀A200購自杭州朗基科學儀器有限公司;電泳儀JY300E購自北京君意東方電泳設備有限公司;立式高壓蒸汽滅菌器LDZF-50L購自上海申安醫療器械廠。
1.3實驗動物
昆明小鼠48只，體重均為20g左右，雄雌各半，購自斯貝福生物技術有限公司。
1.4α毒素檢測
從病死送檢梅花鹿腎臟和腸內容物各取黃豆大小樣本，分別加入裝有1mLPBS(pH=7.4)的EP管，加入4粒磁珠，勻漿器將標本勻漿充分，2000r·min-1離心20min，收集上清待檢。按照微生物產氣莢膜梭菌a毒素(CPA)酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書步驟檢測樣本中
1.5細菌分離鑒定及毒素分型
1.5.1細菌分離鑒定用滅菌槍頭從病死梅花鹿腸內容物中挑取黃豆大小的樣品加入含有10mL梭菌增菌培養基(RCM)的試管中，置于搖床42℃，180r·min-1培養18h。將陽性培養物劃線于胰
胨胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基(TSC),42℃厭氧培養12h，觀察菌落形態，挑選圓形黑色菌單落接種于RCM,42℃,180r·min-1培養18h后劃線于7%羊血瓊脂培養基。觀察菌落形態，挑選有溶血環的灰白色單菌落進行革蘭染色鏡檢。
1.5.2 16S rRNA檢測使用16S rRNA通用引物(表1)進行PCR擴增。PCR反應體系50μL:2xGreen Taq Mix25μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL,ddH2O 21μL。PCR反應條件:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸90s,共30個循環;72延伸10 min;4℃保溫。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證后,送至擎科生物(北京)公司進行測序。將測序所獲序列于NCBI中進行BLAST比對分析，MEGA構建系統進化樹。
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