?梅花鹿源A型產氣莢膜梭菌的分離鑒定、測序、毒素型、生化、耐藥性分析（二）
1.5.3 PCR毒素分型鑒定取純化后的菌液作為模板，反應體系為模板2μL，上、下游引物各1μL,2x Green Taq Mix 10μL,ddH2O補足20μL,每對引物單獨體系。參照Nguyen等的引20μL,每對引物單獨體系。參照Nguyen等的引物序列對分離株毒素進行鑒定,引物信息見表1。反應條件:95℃預變性3 min;95℃變性30 s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環;最后72℃延伸10 min。產氣莢膜梭菌分型系統為A型(cpa+)、B型(cpa+,cpb+,etx+)、C型(cpa+,cpb+,cpe+/-)、D型(cpa+,etx+,cpe+/-)、E型(cpa+,itx+,cpe+/-)、F型(cpa+、cpe+)、G型(cpa+、NetB+)。
1.6生化鑒定
嚴格按照微量生化反應管使用說明和判定原則對分離株進行生化反應鑒定，分別進行了蔗糖、鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、木糖、棉子糖、乳糖、阿拉伯糖、明膠、硝酸鹽、硫化氫、尿素共13種生化鑒定反應，反應結果與《伯杰氏鑒定細菌學手冊》第八版中產氣莢膜梭菌菌株生化特征進行比對。
1.7藥敏試驗
根據臨床和實驗室標準研究所(CLSI)推薦的Kirby-Bauer紙片擴散法測定分離菌對21種常用抗菌藥物的敏感性。挑TSC上單菌落接種于RCM培養基,石蠟液封,42℃培養,當OD{}_{600~nm}=0.6~0.8時,吸取300μL菌液均勻地平鋪于Muel-ler-Hinton瓊脂,隨后將21種抗生素藥敏紙片放置于培養基上,42℃厭氧培養24h。利用游標卡尺測量抑菌圈直徑,并參照CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗執行標準》和制造商的說明書對分離菌的耐藥情況進行判定。
1.8半數致死量檢測及病理觀察
48只小鼠隨機分為6組，每組8只，雌雄分籠，1~5組為試驗組(D1~D5組),6組為健康對照組(H組)。通過預試驗檢測LD。和LD100。將LD
作為第1組攻毒劑量,LD100作為最后1組攻毒劑量,各組劑量按等比排列,公比r=√LD100/LD0(G為組數)將小鼠隨機分成G組，每組8只小鼠。試驗組每只小鼠腹腔注射菌液0.2mL,對照組每只小鼠腹腔注射0.2mL無菌生理鹽水。注射后密切觀察小鼠3d內死亡情況并做好試驗記錄，癥狀明顯的小鼠采樣心、肝、脾、肺、腎、小腸等組織制作病理組織切片并觀察。使用SPSS19.0軟件錄入數據，按照“分析”→“回歸”→“概率P”→“確定”的步驟分析計算，當P=0.5時所對應的值即為菌株的LD50及95%置信區間。
繪制標準回歸曲線為y=0.0064x+0.221 9,R2=0.9784具有強相關性(P<0.001)。腎臟和腸內容物樣本OD{}_{450~nm}分別為0.624、1.003,帶入回歸曲線計算可得肝臟和腸內容物中a毒素含量分別為62.86、122.12 ng·mL{}^{-1}。
2結果
2.1 a毒素鑒定
以標準品濃度作橫坐標,對應 OD值作縱坐標,繪制標準回歸曲線為y=0.0064x+0.2219,R2=0.9784具有強相關性(P<0.001)。腎臟和腸內容物樣本 OD450nm 分別為 0.624、1.003,帶入回歸曲線計算可得肝臟和腸內容物中 α毒素含量分別為62.86、122.12ng·mL-1。
2.2 細菌分離鑒定及毒素分型
2.2.1 細菌分離鑒定分離菌株在RCM液體培養基中生長時出現渾濁并產生氣泡;在胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂(TSC)培養基上形成直徑2~5mm的外圍含有一圈白色暈圈的圓形黑色菌落(圖1A);在7%羊血瓊脂培養基上可形成表面光滑、顏色灰白、透明狀的圓形菌落(圖1B);鏡檢為革蘭陽性短桿菌(圖1C)。
2.2.2 16S rRNA檢測16S rRNA基因PCR擴增產物大小約為1500bp(圖2),與預期長度一以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，
A.TSC培養基;B.7%羊血瓊脂培養基;C.鏡檢結果(10x100)
圖1分離株的培養特性及染色鏡檢
致。將測序結果在NCBI進行相似性比對，結果顯示分離株與產氣莢膜梭菌參考菌株相似率均在99%以上，確定該分離株為產氣莢膜梭菌，且與新疆上傳的產氣莢膜梭菌序列(PP627254.1)處于同一分支(圖3)，親緣關系較近。
2.2.3 PCR毒素分型鑒定
如圖4所示，多重PCR結果顯示分離株僅在cpa基因處出現目的條帶，條帶大小符合預期的324bp，未擴增出其余毒素分型基因，該菌株為A型產氣莢膜梭菌。
2.3生化試驗鑒定
分離株能發酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖，液化明膠,硝酸鹽還原試驗、硫化氫試驗陽性;不能發酵鼠李糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、棉子糖，尿素試驗陰性,符合《伯杰氏鑒定細菌學手冊》中產氣莢膜梭菌生化特性。
2.2.2 16S rRNA檢測16S rRNA基因PCR擴增產物大小約為1500bp(圖2),與預期長度一樣。
M.DNA相對分子質量標準;1.分離株樣本;N.空白對照
圖2 16S rRNA基因PCR擴增電泳圖
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