副溶血弧菌活菌計數方法：MTT比色法、ATP生物發光法和高通量生長曲線（四）
2.4副溶血弧菌菌液檢測
分別采用MTT比色法、ATP發光法和高通量生長曲線法對10份不同濃度的副溶血弧菌菌液進行檢測，并與平板計數法進行比較(圖9)。結果顯示，MTT法計數的9個在線性范圍內的樣品計數值的對數(LgCMTT)與平板計數法結果的對數(LgCP)之間具有極顯著的線性關系(R2=0.9620，P=3.42×10-7)，其關系式為LgCMTT/LgCP=1.0123(圖9)。9個樣品的變異系數為(18.50±12.03)%，超出檢測線性范圍的1個樣品的濃度為4.82×106 CFU/ml，其變異系數為36.61%。ATP發光法計數的9個在線性范圍內的樣品計數值的對數(LgCATP)與平板計數法的結果的對數(LgCP)之間具有極顯著的線性關系(R2=0.9981,P=1.72×10-11)，其關系式為LgCATP/LgCP=0.9981(圖9)。9個樣品的變異系數為(8.59±5.90)%，超出檢測線性范圍的1個樣品的濃度為6.43×103 CFU/ml，其變異系數為23.65%。高通量生長曲線法計數的9個在線性范圍內的樣品計數值的對數(LgCG)與平板計數法結果的對數(LgCP)之間具有極顯著的線性關系(R2=0.9985,P=3.89×10-11)，其關系式為LgCG/LgCP=0.9985(圖9)。9個樣品的變異系數為(9.78±7.46)%，超出線性范圍的1個樣品的濃度為77.00 CFU/ml，其變異系數為68.43%。
圖9 3種高通量活菌計數法與平板計數法的結果比較
上述3種方法與平板計數法的比較顯示，ATP發光法和高通量生長曲線法的曲線斜率很接近1，說明這2種方法與平板計數法得出的結果高度接近，而MTT法的斜率與1有所偏離，而且在偏低或偏高濃度上有明顯系統誤差，說明這一方法所得結果存在一定誤差。
3討論
平板計數作為活菌計數的最基本方法，通常能應用于大多數需要進行活菌計數的場合，但在一些研究不同培養條件，例如液體發酵(高戈等,2017)或固體發酵(孫靜等,2017)等；理化因素，例如消毒劑或紫外線等處理；藥物制劑，例如中草藥或抑菌劑等；這些對特定細菌生長或存活的影響效果時，需要大量的活菌計數工作，而平板計數方法由于工作量大，材料消耗大，在用到這些大量研究對象時效率很低，且不確定度高(凌云等,2010)，因此，需要高效可靠的活菌計數方法。工作效率較高的細菌計數法可采用酶標板的高通量OD值測定，但該方法并不能區分樣本中的活菌和死菌，而且如果樣本中存在大量帶顏色的或懸浮物等干擾光吸收的物質時(孫靜等,2017)，就難以進行直接的OD值測定。因此，需要其他的活菌計數方法以彌補在特定應用中的不足。
MTT比色法操作相對簡單，能滿足高通量操作的需求，適用于較高濃度的活菌數檢測，但其檢測的線性范圍只有2個數量級的跨度。當活菌數較低時，MTT的反應產物過低，從而在OD555 nm值太低而超出檢測的線性范圍，不適用于檢測濃度太低或太高的細菌，由于高通量分析實驗的場合常常會有細菌數量大大偏離MTT檢測范圍的情況發生，這種方法實際上在高通量活菌計數的應用中受到了較大局限，與之前報道的MTT比色法在大腸桿菌活菌計數研究的結論相符合(汪志榮等,2011)。對7.8×106~2.5×108 CFU/ml線性范圍內的實際樣品進行檢測時，所得結果與平板計數結果有一定偏離，5×106 CFU/ml以下的檢測結果可能會有明顯偏差。此外，不同種類和不同生理狀態的細菌中琥珀酸脫氫酶含量可能不同，對多種細菌混合檢測的適用性可能受影響。
ATP生物發光法操作更加簡便，是3種方法中檢測速度最快的，準確性比MTT法高，反應速度較快，能對樣品進行實時的檢測反饋，線性范圍能達到4個數量級的跨度。對1×104~3×108 CFU/ml跨度的線性范圍內的實際樣品進行檢測時，所得結果與平板計數結果高度吻合，對104 CFU/ml以下的檢測結果偏差明顯增加(Chen et al,2006)。在檢測較低濃度的活菌時，需要較長的檢測時間來收集微弱的發光，對于大量樣品的高通量檢測來說，順序檢測過程會造成前后樣品的時間差太大，ATP的發光會逐漸消散而對準確性造成顯著影響(發光會逐漸消散而對準確性造成顯著影Selan et al,1992)。因此，該方法也不適于大樣本量的高通量檢測。此外，如果樣品中有其他來源的ATP干擾，也會對分析的準確性產生很大的影響。
高通量生長曲線法準確性略低于ATP發光法，在本研究的手動操作條件下，檢測的線性范圍達7個數量級以上，對特別低或特別高的活菌數都能進行有效檢測。對100~107 CFU/ml跨度的線性范圍內的實際樣品進行檢測時，所得結果與平板計數結果高度吻合，102 CFU/ml以下的實際樣品檢測時有誤差增大的可能，與Brewster(2003)的研究結果相符。高通量生長曲線法操作耗費時間較長，而且需要定時對OD值進行測定，如果完全人工手動操作，這個過程將較為辛苦。該方法不需要借助特別試劑，可以不受試劑缺乏的限制而得以應用。如果有自動生長曲線測定儀，那這樣的操作將十分方便，而且能進一步增加其檢測的線性范圍和結果的準確性。
綜合比較3種高通量方法：ATP生物發光法與高通量生長曲線法有很好的準確性，MTT比色法準確度稍差；而高通量生長曲線法有最寬的線性范圍，也最適合高通量測定。
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