脂肽對蜜蜂球囊菌生長抑制作用及其孢子萌發(fā)的影響（二）
1.2.3體外抑菌試驗(yàn)
采用瓊脂擴(kuò)散法檢測脂肽Surfactin、Fengycin、Iturin對蜜蜂球囊菌的抑制作用。將直徑6mm的菌餅接種于固體培養(yǎng)基中央，用打孔器在距離中心20mm處打1個(gè)直徑6mm的孔,每個(gè)平板的孔中分別加入1mg/mL的Surfactin、Fengycin和Iturin 50μL,30℃培養(yǎng)4d后觀察蜜蜂球囊菌生長情況。
1.2.4抑菌試驗(yàn)
?孢子懸浮液制備:蜜蜂球囊菌產(chǎn)生孢子后，用接種環(huán)刮取孢子于離心管中，盡量避免刮下菌絲，加入少量PDB培養(yǎng)基進(jìn)行研磨破壁處理，使孢子全部釋放，以鏡檢計(jì)數(shù)方式配成10?CFU/mL的孢子懸浮液。
?MIC測定:在96孔板A1~H1中加入1 mg/mL的Iturin溶液200μL，其余孔每孔加入100μL生理鹽水，然后從A1~H1孔中各吸取100μL加入到A2~H2孔中混勻，以此類推，直至A10~H10孔為止。取一塊新的96孔板，對應(yīng)Iturin溶液工作板，孔孔對應(yīng)加入相應(yīng)濃度Iturin溶液10μL。新板第11列(A11~H11)不加Iturin用于陽性生長對照，加入10μL生理鹽水補(bǔ)足體積，A12~H12正常加入10μL Iturin溶液。向新板A1~H11每孔加入90μL孢子懸浮液并混勻，第12列(A12~H12)不加孢子懸浮液用于陰性空白對照，加入90μL PDB培養(yǎng)基補(bǔ)足體積。此時(shí)新板從左到右的孔中Iturin濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.2μg/mL,制備55組平行以確保數(shù)據(jù)量。將新板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，測定D???nm值。D???nm值越大，Iturin抑菌效果越差;吸光度值越小，Iturin抑菌效果越好，采用累積分布法重復(fù)測定3次，計(jì)算Iturin對蜜蜂球囊菌的MIC??和MIC??。
?MFC測定:取6.25、12.5、25、50和100μg/mL Iturin,分別接種于事先滅菌的PDA平板上，用涂布棒均勻涂布，培養(yǎng)7d后觀察生長情況。蜜蜂球囊菌完全不生長的培養(yǎng)基對應(yīng)的最小濃度即為Iturin對菌蜜蜂球囊菌的MFC值，重復(fù)測定3次。
1.2.5孢子萌發(fā)和凋亡測定
取5只無菌試管，分別加入1mL 10?CFU/mL的孢子懸浮液，添加Iturin溶液，使Iturin最終濃度分別為0(對照)、6.25、12.5、25和50μg/mL，每個(gè)濃度制備4平行，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,BioSense微生物快速立體計(jì)數(shù)儀觀察瓊脂盤中孢子萌發(fā)情況,計(jì)算孢子萌發(fā)率。
孢子萌發(fā)率(%)=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100%
上述溶液依次經(jīng)甲醇和PBS清洗處理，碘化丙啶(PI)染色后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞凋亡情況。
1.2.6細(xì)胞膜麥角甾甾醇含量測定
參照張岱方法用6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin處理菌絲，無菌水處理菌絲作為對照組，48h后收集菌絲，加入2mL乙醇，充分研磨，超聲提取1h，過夜浸提，離心取上清液，上機(jī)檢測，重復(fù)測定3次。高效液相色譜條件為:色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),柱溫30℃,檢測波長282nm,流速1mL/min,進(jìn)樣體積10μL,流動(dòng)相為甲醇。
1.2.7細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量測定
參照朱曉蘭等方法并稍加改動(dòng)，將菌絲置于6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin中處理48h,對照組用純水進(jìn)行相同處理，稱取40mg處理好的菌絲，加入9mL 8 mol/L的HCl中，于110℃烘干箱中水解4h，水解結(jié)束后取出，冷卻至室溫，將水解液過濾至25mL容量瓶內(nèi)，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一容量瓶內(nèi)，用水定容至刻度，振蕩混勻。
吸取上述水洗液1.0mL到離心管內(nèi)，用氮吹儀氮?dú)獯蹈桑瑢?.5mL 0.2mol/L硼酸鈉溶液及5mL 1.3mg/mL的FMOC-CL乙腈溶液加入干燥后的試管內(nèi)，溶解殘留物，振蕩混合后在室溫下反應(yīng)2h，衍生后的溶液可直接進(jìn)行色譜分析，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。高效液相色譜條件:色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),柱溫25℃,流動(dòng)相為乙腈、水，流速1mL/min，紫外檢測波長254nm。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 10.1.2軟件Student's t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。
2結(jié)果
2.1菌株鑒定
2.1.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定
分離菌菌絲外觀呈白色絨毛狀，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d左右便可鋪滿整個(gè)平板(圖1A);異性菌絲在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生黑色的子實(shí)體(圖1B);菌絲呈現(xiàn)分枝狀，有隔膜，能在基質(zhì)上延伸生長，形成一個(gè)網(wǎng)狀的菌絲體(圖1C);孢子囊呈黑色半透明的球狀，內(nèi)部包含數(shù)十個(gè)孢子球，孢子囊破裂時(shí)釋放出圓形的孢子球，孢子球是孢子的集合體，孢子球裂解產(chǎn)生大量半透明的橢圓形孢子(圖1D)。
在普通光學(xué)顯微鏡下，用測微尺對分離菌的孢子囊、孢子球、孢子及菌絲進(jìn)行測量，結(jié)果如表1所示。分離菌孢子呈橢圓形，長度為2.1~3.1μm，寬度為1.4~1.7μm,差別不大,孢子球中包含數(shù)個(gè)孢子，直徑為12~16μm不等，孢子球被孢子囊包裹，孢子囊直徑在66~80μm之間,在培養(yǎng)基中可肉眼直接觀察到。菌絲直徑為3~6μm。
表1分離菌菌體各部分顯微測量值(μm)
2.1.2分離菌分子生物學(xué)鑒定
18S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知，在約600bp處有明亮條帶。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對，結(jié)果與蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,GenBank登錄號(hào):GQ867785.1)18S rDNA序列相似性最高，為100%，確定該菌種為蜜蜂球囊菌。
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