銀杏黑斑病和輪紋病病菌生長、產孢試驗和孢子萌發試驗（一）
摘要對銀杏黑斑病菌(Alternaria tenuis Ness)和輪紋病菌(Pestalotia ginkgo Hori)進行生長、產孢條件和孢子萌發試驗。結果表明，銀杏黑斑病菌生長、產孢溫度為10℃~35℃，25℃生長最好，35℃產孢最多，20℃~35℃孢子萌發良好；輪紋病菌生長溫度為10℃~30℃，最適25℃，10℃下不產孢，20℃孢子萌發率最高。2種菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上生長旺盛，在相對濕度(RH)65%~98%生長良好，且加大RH有利于分生孢子形成，RH 100%+水滴處理孢子萌發率最高。2種菌生長的pH值為2~11，偏酸性利于分生孢子萌發。葡萄糖、葉汁有促進輪紋病菌分生孢子萌發作用；光照對黑斑病菌的生長和產孢沒有顯著影響，但能促進輪紋病菌孢子形成。
銀杏黑斑病和輪紋病是銀杏成株期葉片的主要病害，幾乎遍布所有的產區。在廣西銀杏產區內，由于推廣應用早實豐產技術，進行大面積集約化栽培，銀杏品種資源進一步單一化，這2種病的危害越來越大，嚴重地影響了銀杏果實的數量和質量、以及銀杏葉黃酮類物質的提取和系列產品加工。黑斑病和輪紋病常相伴發生，為了探討其發生規律，更有效地進行防治，本文對2種病菌的生物學特性進行生長、產孢試驗和孢子萌發試驗。
1 材料
1.1 供試菌株
黑斑病菌(A.tenuis)和輪紋病菌(P.ginkgo)菌株，根據文獻進行分離鑒定，純化、培養備用。
1.2 培養基
PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)、WA(水瓊脂培養基)、GLA(銀杏葉汁葡萄糖瓊脂培養基。將45片健康的銀杏葉，加10mL蒸餾水，于研缽中研磨，用紗布過濾，與溶化的500mL葡萄糖瓊脂液混合均勻，分裝后滅菌)。
1.3 培養液
1%葡萄糖液、銀杏葉汁培養液(將銀杏葉汁用蒸餾水稀釋)、無菌水。
2 方法
2.1 病原菌生長和產孢試驗
2.1.1 溫度試驗
將2種菌株分別在PDA平板上復壯培養3d~4d，用滅菌的打孔器(直徑4mm)打取菌落邊緣的菌塊，移植到PDA平板上，置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫箱中培養，每處理4次重復。
每2d測1次菌落生長直徑，并記錄菌落形態、顏色變化、分生孢子開始形成的時間等。黑斑病菌培養15d，從每個處理中隨機抽取一皿，用打孔器(直徑7mm)打取菌塊(鑒于黑斑病菌產孢量大)，用10mL蒸餾水將孢子洗下，加1~2滴Tween-80，振蕩搖勻，制成均勻的孢子懸浮液，從中取4滴于載玻片上，在20×10倍顯微鏡下鏡檢，每滴計測9個視野的孢子數，取其平均值，進行方差分析，統計各處理間的差異顯著性。輪紋病菌培養30d，從每處理中隨機抽取一皿，用10mL蒸餾水將孢子洗下，制成均勻的孢子懸浮液。檢測和分析方法同黑斑病菌。
2.1.2 濕度試驗
菌塊按2.1.1移植方法，置于用不同濃度的H?SO?控制不同濕度的密閉容器中培養，設4個處理：RH 65%、RH 75%、RH 85%、RH 98%，每處理4次重復，培養溫度25℃。觀測方法和記錄項目同2.1.1。
2.1.3 培養基試驗
用接種環輕取復壯好的菌絲，移植到PDA、WA、GLA培養基中培養，每處理4次重復，培養溫度25℃。觀測方法和記錄項目同2.1.1。
2.1.4 酸堿度試驗
用1M HCl和1M NaOH將PDA培養基調配成6個不同pH值：2、4、5、7、9、11，按2.1.1方法移植接種，每處理4次重復，于25℃條件下培養。觀測方法和記錄項目同2.1.1。
2.1.5 光照試驗
菌塊移植方法同2.1.1，先置于25℃恒溫箱中培養4d~5d，然后分別進行完全黑暗(用黑色塑料袋套住)、自然光照射、日光燈照射共3個處理，每處理4次重復。觀測方法和記錄項目同2.1.1。
2.2 孢子萌發試驗
2種菌分別在PDA培養基上復壯培養約1個月，分別用10mL無菌水將孢子洗下，加1~2滴Tween-80，搖勻，稀釋制成均勻的分生孢子懸浮液，濃度是在10×10倍顯微鏡下每視野約80個孢子。
| 溫度 Temperature (℃) | 黑斑病菌(A.tenuis) | 輪紋病菌(P.ginkgo) | ||||||||||
| 生長速度 Growth velocity (mm/d) | aa05 | αa01 | 產孢量 Conidial production (個/視野) | 00.05 | α0.01 | 生長速度 Growth velocity (mm/d) | aa05 | aa01 | 產孢量 Conidial production (個視野) | α0.05 | αa01 | |
| 10 | 2.60 | d | D | 8.4 | d | C | 3.15 | e | E | 0 | c | C |
| 15 | 4.15 | c | C | 11.0 | bc | B | 4.84 | d | D | 23.0 | b | B |
| 20 | 5.03 | b | B | 5.8 | e | D | 5.47 | b | B | 48.4 | a | A |
| 25 | 5.66 | a | A | 120 | b | B | 7.88 | a | A | 44.0 | a | A |
| 30 | 4.70 | b | BC | 10.6 | c | B | 5.15 | c | C | 22.7 | b | B |
| 35 | 2.78 | d | D | 25.1 | a | A | 0 | f | F | 0 | c | C |
表1不同溫度對黑斑病菌和輪紋病菌生長和產孢的影響
2.2.1 溫度試驗
用吸管吸取孢子懸浮液，滴于載玻片上，加蓋玻片，置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫箱中保濕培養，每處理4次重復，分別于8h、24h進行鏡檢，每處理計測500個以上分生孢子的發芽率，取其平均值，進行方差分析，統計各處理間的差異顯著性。
2.2.2 濕度試驗
設4個處理：泡水(在培養皿中加5mm深的分生孢子懸浮液)，以及將分生孢子懸浮液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于用濃H?SO?控制不同相對濕度RH 90%、RH 100%、RH 100%+水滴的干燥器中培養，經8h、24h鏡檢孢子的發芽情況，每處理4次重復，培養溫度為25℃。
2.2.3 酸堿度試驗
用1M HCl和1M NaOH將分生孢子懸浮液調配成2、4、5、7、9、11共6個不同的pH值，用吸管分別吸取，滴于載玻片上，置于25℃恒溫箱中保濕培養，每處理4次重復。
2.2.4 培養液試驗
分別用無菌水、1%葡萄糖液、銀杏葉汁培養液配制成3種分生孢子懸浮液，并將濃度調至在10×10倍顯微鏡下每視野約80個分生孢子，滴于載玻片上，于25℃恒溫箱中保濕培養。
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