基于可培養技術的古象牙病害微生物分離鑒定與抑菌劑篩選評價（三）
2.3菌株系統發育分析
4株細菌經16S rRNA序列測定后，將序列提交至GenBank數據庫(登錄號OL518985-OL518988)，并通過在NCBI上對測定序列進行BLAST比對分析，選取相似度最高的菌株，確定菌株屬、種，構建系統發育樹(圖5)。結果表明古象牙表面分離獲得的4株可培養細菌分屬于紅球菌屬(Rhodococcus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞屬(Pseudomonas)、貪銅菌屬(Cupriavidus)4個屬。
29株真菌經ITS序列測定后，將序列提交至GenBank數據庫(登錄號OL604334-OL604362)，并通過在NCBI上對測定序列進行blast比對分析，選取相似度最高的菌株，確定菌株屬、種(表2)，構建系統發育樹(圖6)結果顯示兩種古象牙殘片表面所分離獲得的可培養真菌并無明顯差別，但XY51-1殘片上的真菌種類相對豐富，且在XY51-2殘片上分離的真菌屬大部分在XY51-1殘片上皆有發現，兩種古象牙殘片可培養真菌種類的差異可能與其出土時間有關，XY51-1殘片相較于XY51-2殘片出土時間更晚，其暴露于環境中的時間更久，受環境中空氣、水分、溫度等的影響更大，這可能是導致其表面真菌種類更豐富的重要原因。從兩種古象牙殘片表面共分離出3個門16個屬的真菌，其中子囊菌門(Ascomycota)包含7個屬，分別為枝胞屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、土赤殼屬(Ilyonectria)、黑孢霉屬(Nigrospora)、黑陷球殼屬(Trematosphaeria)、曲霉菌屬(Aspergillus)；擔子菌門(Basidiomycotina)包含7個屬，分別為田頭菇屬(Agrocybe)、鬼傘屬(Coprinellus)、栓菌屬(Trametes)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、擬層孔菌屬(Fomitopsis)、蠟孔菌屬(Ceriporia)、煙管菌屬(Bjerkandera)；半知菌門(Deuteromycetes)包含2個屬，為附球菌屬(Epicoccum)、鏈格孢屬(Alternaria)。
2.4細菌抑菌效果
將菌株接種于含有不同抑菌劑的MHA平板上置于30°C恒溫培養24 h后，通過觀察細菌生長狀況可知，苯并咪唑抑菌效果最差，對除B6菌株外的3種菌株濃度到2048 mg/L也無抑菌效果，且菌落生長旺盛，所以在后續復配實驗中將其淘汰。而其他3種抑菌劑對菌落都有不同程度的抑制作用，其中苯扎氯銨對分離菌株B6、B12、B13、B106的最小抑菌濃度分別為4、4、64、16 mg/L；三氯生對分離菌株B6、B12、B13、B106的最小抑菌濃度分別為2、0.5、256、0.5 mg/L(圖7)；特泯菌對分離菌株B6、B12、B13、B106的最小抑菌濃度分別為1、8、2、2 mg/L(表3)。可見，除苯并咪唑外，苯扎氯銨、三氯生、特泯菌的抑菌效果均隨著抑菌濃度的增加而增加，其中苯扎氯銨、三氯生、特泯菌能同時抑制4株供試菌的MIC值分別為64、256、8 mg/L。
綜合各抑菌劑抑制供試細菌的MIC值，將苯扎氯銨、三氯生、特泯菌3種抑菌劑進行兩兩復配后觀察其抑菌效果。將各抑菌劑能抑制所有供試細菌生長的最低濃度減半后進行兩兩復配，若能完全抑制供試菌株生長則繼續對復配濃度減半，直至篩選出能抑制所有供試菌株生長的最低復配濃度。結果表明，抑菌劑的復配濃度分別為苯扎氯銨16 mg/L、三氯生64 mg/L、特泯菌2 mg/L時能完全抑制供試菌株的生長，其中組合苯扎氯銨和特泯菌復配濃度分別為16 mg/L和2 mg/L時效果最佳(表4)，說明抑菌效果不僅受抑菌劑濃度的影響，同時也與抑菌劑的組合有關。
2.5真菌抑菌效果
不同抑菌劑對各真菌的抑菌結果表明，苯并咪唑濃度達到2000 mg/L都不能完全抑制所有供試真菌的生長，抑菌效果最差。由于在試驗過程中還發現苯并咪唑的母液濃度為20500 mg/L左右時，基本已經達到飽和濃度不能再提高，因此在后續復篩中不再使用。其余3種抑菌劑能夠完全抑制所有供試真菌生長的濃度分別為苯扎氯銨8000 mg/L，制霉菌素和三氯生均為400 mg/L(圖8)，說明不同抑菌劑對真菌的抑菌效果存在較大差異(表5)。
根據各抑菌劑對供試真菌的MIC值，采用二倍稀釋法配置復配抑菌劑，接種供試菌株于不同復配濃度的PDA平板，置于25°C恒溫培養5 d觀察各菌株生長狀況。結果表明，制霉菌素與苯扎氯銨分別按200 mg/L和4000 mg/L進行復配時，可完全抑制所有供試真菌的生長；而三氯生和制霉菌素的復配濃度均為200 mg/L時，除菌株A17不能抑制外，可抑制所有供試菌株的生長(表6)。