特定精油可有效根除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜（二）
其他抗菌精油在殺死銅綠假單胞菌生物膜方面的效果是否與肉桂油一樣？為了回答這個問題，我們根據臨床實驗室和標準研究所的協議使用MHB瓊脂在盤擴散試驗中篩選了可以殺死銅綠假單胞菌PAO1的精油。這些精油由Aura Cacia和New Directions Aromatics提供，并被描述為100%純度。每種精油的20微升未經稀釋地點在由3層Whatman濾紙制成的濾紙盤上。我們的數據表明，以下精油在殺死銅綠假單胞菌方面有效：肉桂、丁香（Syzygium aromaticum）、秘魯香膏（Myroxylon balsamum），紅迷迭香（Thymus vulgaris）和茶樹（Melaleuca alternifolia）精油（圖2）。為了考慮這些精油可能穿透瓊脂的程度不同，導致看似抗菌效果降低的可能性，任何產生可見抑制區的精油都被考慮用于后續實驗。
圖2擴散試驗鑒定出具有抗菌活性的精油。抗生素濃度為20 mg ml?1(A)和純精油(B)被測試對銅綠假單胞菌PAO1。產生抑制區的物質進一步分析；薰衣草油作為陰性對照。
在下一步中，我們探討了在盤擴散試驗中表現出活性的油是否在殺死生物膜方面也有效。為了研究這一點，我們確定了每種油的兩個參數：殺死懸浮細胞所需的最低抑制濃度（MIC）和最小生物膜消除濃度（MBEC）。生物膜是在MBEC裝置（Innovotech Inc.，加拿大埃德蒙頓）上生長的，這是一個經過修改的微孔板，蓋子上附有96個聚苯乙烯釘。釘子浸泡在含有10的MHB培養基中?個細胞/ml，37°C和30°C振蕩培養P.aeruginosa PAO1和P.putida KT2440，分別。24小時后，長在釘子上的生物膜被沖洗，并按照圖3所示，在陽離子調整的MHB中進行1:1的抗生素和精油的系列稀釋；稀釋精油的培養基中補充了0.1%的吐溫。挑戰培養基的體積為200μl，測試的抗生素和精油的最高濃度為100μg ml?1和5%，分別。青霉素和薰衣草分別作為抗生素和精油的陰性對照。經過2小時的培養后，將peg洗滌，浸入150μl新鮮的MHB中，并在Branson 2510超聲波發生器（40 kHz）中超聲10分鐘，以釋放和解離與peg相關的生物膜。通過將peg從蓋子上折斷并分別在含有200μl磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）的微量離心管中超聲來確定每個peg上的平均細胞數。將所得溶液進行系列稀釋并接種，以確定CFU。CFU計數顯示，每個peg上的平均細胞數為3×10?個PAO1和4×10?個。對于KT2440。為了獲得MIC，每孔加入相同數量的planktonic細胞，以抗生素或精油進行挑戰。2小時后，每孔加入20μl到新鮮的MHB中。經過過夜培養后，確定每種化學物質最低的濃度，以防止生物膜和planktonic細胞的存活。實驗重復三次，確定平均MIC或MBEC。
圖3選定抗生素和抗菌精油對銅綠假單胞菌PAO1(A,B)和粘細菌KT2440(C)的活性。通過挑戰細菌（無論是游離狀態還是在生物膜內）來確定各種物質的MIC和MBEC。星號表示數據超出了圖表的范圍，表明在測試濃度下沒有觀察到殺傷作用。每個實驗都進行了三次重復，誤差棒表示標準誤差。
圖3A和B顯示了每種測試物質的MIC和MBEC。只有單一的抗生素，氧氟沙星，能夠以幾乎相同的效果根除planktonic和生物膜細菌。其他抗生素，多粘菌素和gentamicin，在濃度比MIC高10倍的情況下，仍然無法有效殺死生物膜。相比之下，卡西和秘魯香膏的精油在幾乎相同的濃度下對生物膜和planktonic細菌有效。這一觀察結果確認了圖1的結果。對于肉桂油，觀察到MIC和MBEC差異很小。有趣的是，紅迷迭香油在濃度約為2%時對生物膜有效，但在任何測試濃度下都無法殺死游離細胞。這表明迷迭香油對生物膜的效力比對溶液中細菌的效力更高。為了確定統計顯著性，我們進行了單樣本t檢驗，將生物膜種群與游離細胞種群的平均值進行比較。由于紅迷迭香的游離細胞種群在最高測試濃度下未被殺死，我們使用最大值（5%）作為種群平均值，以查看在該水平上是否可以檢測到顯著性。確實，PAO1和KT2440的游離細胞和生物膜種群之間的差異具有顯著性(P<0.05)，表明紅迷迭香油對生物膜的抑制效果比對游離細胞的效果更好。我們得出結論，這里測試的精油對生物膜的抑制效果比測試的抗生素更好。
為了測試精油對潛在菌株特異性的影響，我們評估了它們對鄰近菌株（KT2440）的影響（圖3C）。我們的數據表明鄰近菌株比銅綠假單胞菌對丁香、紅百里香和茶樹油更敏感（圖3）。這種效果在丁香油上尤為明顯，丁香油沒有消除PAO1，但對KT2440生物膜和懸浮細胞有很強的抑制作用（圖3）。使用單一樣本t檢驗比較鄰近菌株和銅綠假單胞菌的丁香油數據（假設銅綠假單胞菌樣本為5%），我們發現丁香油對假單胞菌的影響與對銅綠假單胞菌的影響顯著不同（P<0.05）。此外，紅百里香油在5%的濃度下對游離細菌有效，這是測試的最高濃度，而茶樹油對生物膜細胞有效。由于銅綠假單胞菌在測試的最高濃度下仍然存活，我們無法計算這些情況下的統計顯著性。兩種假單胞菌這些菌株表明了這些精油對特定物種的活性，并表明可能有特定的抗性機制在起作用。例如，由于某些精油似乎作用于細胞壁或細胞膜，因此這些細胞成分的組成可能是決定對精油敏感性的重要因素。這些精油對特定物種的活性表明，針對不同微生物的定制組合可能對多物種生物膜有效。
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