特定精油可有效根除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜（三）
銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌數據之間的一個相似之處是，紅迷迭香油對生物膜細胞比其planktonic對應物更有效。同樣，茶樹油對陰溝腸桿菌也具有同樣的效果。在濃度為5%或更低時對浮游細菌無效，但在濃度約為4%時對生物膜細菌有效。在這種情況下，處于生物膜中對細菌來說變成了一個不利因素，因為它使它們更容易受到這些特定精油活動的影響。可能的原因是生物膜的細胞外基質吸附了活性成分并增加了其局部濃度。另一種可能性是，由于兩種細胞類型中基因表達的差異，生物膜細胞的細胞膜或細胞壁與浮游細胞不同。
需要注意的是，使用MBEC裝置獲得的數據在使用不同方法培養生物膜的實驗中是可重復的，該方法是將生物膜培養在96孔微孔板的孔中，而不是在聚苯乙烯釘上（圖4）。在該實驗中，除了在培養期間不搖晃培養板，使生物膜在空氣-液體界面的孔壁上生長外，實驗步驟與MBEC裝置相同。此外，生物膜是在TB(10%胰蛋白胨，5%NaCl)而不是MHB中形成。如圖4所示，我們比較了使用兩種方法培養的生物膜的敏感性。使用兩種不同方法培養的生物膜包含相當數量的細胞(2×10?CFU/孔，而不是3×10?CFU/peg)。對于每種物質，除了氧氟沙星，通過每種方法獲得的MBEC值是一樣的。為什么在MBEC裝置上生長的細胞比在96孔板上生長的細胞對氧氟沙星更敏感，尤其是在測試的其他物質沒有顯示出顯著的效率差異的情況下，尚不明確。然而，有可能是培養基或生物膜結構的差異導致了在MBEC裝置上生長的生物膜對氧氟沙星的敏感性增加。
圖4比較兩種生物膜培養方法用于抗生素和精油測試。銅綠假單胞菌生物膜分別在96孔板的孔壁或MBEC裝置的釘子上生長，并測定其對antibiotics和精油的敏感性。
在測試了兩種密切相關的革蘭氏陰性菌后，我們研究了精油對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的影響（圖5）。我們的目標是確定這些精油是否能區分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。本研究中使用的菌株SC-01是一種形成生物膜的、對青霉素和甲氧西林耐藥的臨床分離株。某些精油，如茶樹、百里香和薄荷，對游離態和生物膜的細菌有效。)MRSA。然而，據我們所知，尚未對來自肉桂、紅百里香和肉豆蔻的精油進行過對任何菌株的MRSA生物膜的測試。此外，本研究中使用的菌株（SC-01）在之前的工作中尚未被精油挑戰過。首先，我們進行了紙片擴散試驗，以確定這些對銅綠假單胞菌有效的精油是否也對金黃色葡萄球菌有效。事實上，包括薰衣草油在內的所有測試精油都顯示出一個抑制區（圖5A）。接下來，我們測試了精油對MBEC裝置上的插桿上形成的生物膜的抑制效果。該協議與上述描述相同，每個插桿上的平均細胞數為1.5×10?結果表明，與銅綠假單胞菌有效殺滅的最低或相似濃度的決明油、秘魯香脂油和紅迷迭香油B）能夠殺死生物膜。值得注意的是，這種分離株對青霉素和甲氧西林具有耐藥性，但在本實驗中測試的四種精油中，能夠有效殺死它。
圖5金黃色葡萄球菌SC-01對精油的敏感性。(A)圓盤擴散試驗顯示SC-01對各種精油敏感。(B)通過挑戰planktonic細胞和生物膜，分別確定了精油的MIC和MBEC。星號表示數據超出了圖表范圍，表明在測試濃度下沒有觀察到殺傷作用。每個實驗重復三次，誤差棒表示誤差。
在確定精油對生物膜有效之后，我們測試了精油的各個成分的抗菌效果。我們評估了分子肉桂醛、丁香油酚和芳樟醇（分別來自肉桂、丁香和薰衣草油）對銅綠假單胞菌懸浮細胞和生物膜細胞的影響。這三種成分均來自Sigma-Aldrich。本實驗中使用的方案與測試整個精油的方案相同，包括在培養基中使用吐溫80來懸浮這些在水中溶解度低的成分。表2總結了數據，表明肉桂醛與復雜的肉桂油一樣有效。此外，雖然在5%（體積/體積）的溶液中，丁香油對殺滅銅綠假單胞菌生物膜無效，但肉桂油在3.3%時有效。發現單一的精油成分在消除細菌生物膜方面有效是很有前途的，因為它可能允許我們分解其作用機制，并激發對新抗菌成分的分子設計。
化合物 MIC (% [體積/體積]) MBEC (% [體積/體積])
肉桂醛 0.1 0.2
丁香油 >5 3.3 ± 0.8
芳樟醇 >5 >5
表格2對PAO1的精油成分的MIC和MBECa
每項實驗都進行了三次重復，所展示的結果是三次試驗的平均值。每個成分測試的最高濃度為5%（體積/體積）。在測試范圍內未顯示出抗菌活性的成分的MIC和MBEC值列為“>5%”。除非三次試驗的結果完全相同，否則報告標準誤差。
總之，我們在此證明，肉桂、秘魯香膏和紅迷迭香精油在消除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜方面比選定的重要抗生素更有效，這使它們成為生物膜治療的有趣候選者。重要的未來目標包括確定油中更多的活性抗菌成分，以及這些成分如何有效突破生物膜屏障的分子機制。在這項研究中，我們只取樣了少數不同種類的油，但自然界中還有大量的其他油，具有巨大的發現替代抗生素的潛力。