基于生長速率法評估植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌抑制效果（一）
摘要
摘要：采用生長速率法測定植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌菌絲生長的影響，并對抑菌活性物質的理化性質進行了研究。結果表明，該菌的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌菌絲的生長有抑制作用。發(fā)酵液中的活性物質有較好的熱穩(wěn)定性，在pH6.0時抑菌效果較好，對酸性蛋白酶敏感，對中性蛋白酶不敏感，常溫下10d的穩(wěn)定性較好。通過調節(jié)pH、酶處理和加熱處理實驗，說明其抑菌活性物質不是乳酸，蛋白質類物質起了一定的抑菌作用，但其抑菌現象可能是與其他物質共同作用的結果。
引言
疫霉菌是疫霉屬(Phytophthora)真菌的統(tǒng)稱，隸屬鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉目腐霉科疫霉菌。疫霉菌大多存活于土壤，潛育期短，傳播速度快，侵染力強，對植物破壞性大。病菌侵入寄主植物后在很短的時間內產生大量的孢子囊并釋放游動孢子，成為再侵染源，使該病害難以控制，經常給農業(yè)生產造成巨大損失。
目前對植物卵菌病害依靠化學防治，常用殺菌劑如瑞毒霉、殺毒礬、甲霜靈等藥物。這些藥劑價格昂貴，長期大量施用對人和環(huán)境造成極大危害，因此開發(fā)環(huán)保、高效的生物農藥具有重要意義。
利用有益微生物制約有害微生物，是開發(fā)和利用微生物資源的重要研究領域之一，在植物病害防治中最具潛力，應用前景最為廣闊。
目前已有不少以活體微生物或其代謝產物控制致病疫霉菌及其危害為目的的研究。Fachouri等從P.fluorescens菌株G308中分離出一種新的抗生素N-mercapto-4-formylcar-bostyril(Cbs)，可在體外抑制馬鈴薯晚疫病的孢子萌發(fā)及菌絲體生長；王艷紅等從土壤中篩選出一株放線菌WL70，其代謝產物可抑制番茄早疫病菌。這些研究表明，從微生物代謝產物中分離抗植物致病菌的生物活性成分用于生物農藥開發(fā)是很有可能的。
乳酸菌是能利用可發(fā)酵糖產生大量乳酸的細菌的通稱。目前有關乳酸菌抑菌的報道甚多，但這些報道多集中于對細菌的抑制作用，其產生的抑菌物質主要有有機酸、過氧化氫以及細菌素等。
近年來的研究表明，某些乳酸桿菌可抑制霉菌的生長和產毒。
唐雨蕊等從牛糞中分離出一株乳酸桿菌BN3，它能明顯地抑制黃曲霉的生長，并且對黃曲霉的孢子萌發(fā)有抑制作用。本文對植物乳桿菌Bx6-2發(fā)酵液中活性代謝產物的抑制疫霉作用及理化性質進行了研究，為乳酸菌在生物農藥方面的應用提供實驗依據。
1材料及方法
1.1菌株
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Bx6-2由內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室從酸馬奶中分離得到。甜瓜疫霉菌(Phytophthora.drechsleri Tucker)由天津市植物保護研究所提供。
1.2培養(yǎng)基
V8培養(yǎng)基：V8汁20mL，瓊脂1.5 g，CaCO?0.3 g，蒸餾水80 mL。
MRS培養(yǎng)基：蛋白胨胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，吐溫80 1 mL，檸檬酸三銨2 g，K?HPO?2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，MgSO?·7H?O 0.1 g，MnSO?·4H?O 0.05 g，蒸餾水1000mL，pH 6.5。
燕麥培養(yǎng)基：50 g燕麥片加到1000 mL蒸餾水中，在60°C恒溫水浴鍋中加熱1h，經4層紗布過濾去渣，加蒸餾水稀釋到1000 mL，再加入瓊脂18 g。
PDA培養(yǎng)基：200 g去皮土豆切塊，加入1000 mL蒸餾水，煮沸30 min后2層紗布過濾去渣，加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，稀釋到1000 mL。
上述培養(yǎng)基均在121°C滅菌20 min。
1.3植物乳桿菌培養(yǎng)液的制備
將保存的植物乳桿菌Bx6-2接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h，按1%接種量接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)48h。將其發(fā)酵液以3000 r/min離心20 min，取上清液備用。
1.4不同培養(yǎng)基對甜瓜疫霉菌
將甜瓜疫霉菌接種于V8培養(yǎng)基平板上，25°C培養(yǎng)4 d。用打孔器在菌落邊緣處打取直徑5mm的菌塊，將菌塊分別放在燕麥培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、V8培養(yǎng)基平板的中央，25°C培養(yǎng)4 d后測量各菌落直徑，比較不同培養(yǎng)基對甜瓜疫霉菌菌絲生長的影響，確定其生長的最適培養(yǎng)基。
1.5植物乳桿菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制作用
植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌抑菌活性的測定參照黃雄英等采用的生長速率法，并對該方法進行了適當的改進。將植物乳桿菌Bx6-2的上清液以體積分數為0.5%、1%、2%、4%和8%加入到20 mL的V8培養(yǎng)基中，再分別倒入90 mm直徑的滅菌培養(yǎng)皿內制成平板；以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照。用打孔器在菌落邊緣處打取直徑5mm的菌塊，放置在平板中央，25°C培養(yǎng)4 d，測量菌落直徑(d)，按公式(1)計算抑菌率。
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