基于生長速率法評估植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌抑制效果（二）
1.6抑菌物質(zhì)性質(zhì)
1.6.1溫度穩(wěn)定性
將植物乳桿菌Bx6-2的上清液分別在40、50、60、70、80、90°C水浴中加熱10 min，以甜瓜疫霉菌作指示菌，未處理的Bx6-2上清液作對照，計算相對抑菌率。
相對抑菌率=處理組的抑菌率/對照組的抑菌率*100%
1.6.2不同pH下的抑菌效果
用1 mol/L的NaOH和1 mol/L HCl溶液分別將植物乳桿菌Bx6-2的上清液pH調(diào)為3.0、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0，以甜瓜疫霉菌作指示菌，未處理的Bx6-2上清液作對照，按1.5所述的方法測定其抑菌率。
1.6.3排除乳酸對抑菌活性的影響
以不加發(fā)酵液的V8培養(yǎng)基作為空白培養(yǎng)基；加發(fā)酵液的V8培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基1號；加入pH值與發(fā)酵液相同的乳酸溶液的V8培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基2號；用高效液相色譜法測植物乳桿菌Bx6-2發(fā)酵液中乳酸的含量，加入相同含量的乳酸溶液的V8培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。以甜瓜疫霉菌作指示菌，按1.5所述方法測定其抑菌率。
1.6.4蛋白酶對抑菌活性的影響
將植物乳桿菌Bx6-2的上清液過0.22μm膜，分別加入酸性蛋白酶或中性蛋白酶(1mg/mL)，37℃水浴溫育1h，以甜瓜疫霉菌作指示菌，按1.5所述方法測定其抑菌率。
1.6.5常溫穩(wěn)定性
將植物乳桿菌Bx6-2的上清液經(jīng)0.22μm膜過濾，分別在常溫下放置5、10、15、20d，以甜瓜疫霉菌作指示菌，按1.5方法測定其抑菌率。
2結(jié)果與討論
2.1培養(yǎng)基對甜瓜疫霉菌菌絲生長的影響
甜瓜疫霉菌菌落形態(tài)因培養(yǎng)基種類不同而呈現(xiàn)明顯的差異(圖1)。甜瓜疫霉菌在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d后，菌落的直徑大小不同。燕麥培養(yǎng)基上甜瓜疫霉菌的菌落直徑最大，但菌絲較為稀疏；PDA培養(yǎng)基上的菌落形狀不規(guī)則且邊緣生長不均勻；V8培養(yǎng)基上菌落呈圓形，菌落邊緣生長均勻且規(guī)則。為了使接入的菌塊菌絲量基本一致，并且便于測量菌體直徑，選擇V8培養(yǎng)基作為培養(yǎng)甜瓜疫霉菌的培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)研究。
2.2植物乳桿菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制作用
植物乳桿菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制作用如圖2所示。
由圖2可以看出，植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌菌絲生長有很強(qiáng)的抑制作用，菌絲抑菌率隨發(fā)酵液濃度的降低而減少。當(dāng)發(fā)酵液濃度為8%時，植物乳桿菌Bx6-2的抑菌率達(dá)到了58%，而當(dāng)發(fā)酵液濃度降至0.5%時，其抑菌率仍可達(dá)到30%。
2.3抑菌物質(zhì)的性質(zhì)
2.3.1溫度穩(wěn)定性
植物乳桿菌Bx6-2所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，植物乳桿菌Bx6-2所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)對熱的穩(wěn)定性較好，在60℃水浴中加熱10min后，相對抑菌活性仍在65%以上。然而，當(dāng)處理溫度在60℃以上時，其抑菌效果明顯下降。
2.3.2不同pH下的抑菌效果
植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液在不同的pH下，其抑菌效果也各不相同(圖4)。當(dāng)pH6.0時，抑菌效果達(dá)到最好，在過酸和堿性環(huán)境中其抑菌效果明顯降低。因此，在發(fā)酵液中活性物質(zhì)分離純化和使用過程中應(yīng)保持在pH6.0的弱酸性環(huán)境。
2.3.3排除乳酸對抑菌活性的影響
按照1.6.3的方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌有抑制作用，而空白培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基均沒有對甜瓜疫霉菌產(chǎn)生抑制作用。由此可知，乳酸不起作用，起抑菌作用的是其他發(fā)酵產(chǎn)物。
2.3.4蛋白酶對抑菌活性的影響
植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液經(jīng)酸性蛋白酶和中性蛋白酶處理后，其抑菌活性均有所下降，但仍具有抑菌效果(表1)。經(jīng)中性蛋白酶處理后的抑菌效果好于經(jīng)酸性蛋白酶處理，說明植物乳桿菌Bx6-2產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對酸性蛋白酶的敏感程度比對中性蛋白酶高。由此可見，植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液中蛋白質(zhì)類物質(zhì)起了一定的抑菌作用，但其抑菌現(xiàn)象可能是與其他物質(zhì)共同作用的結(jié)果，還有待進(jìn)一步研究。
表1蛋白酶對植物乳桿菌Bx6-2抑菌活性的影響
| 處理方式 | 菌落直徑/cm | 抑菌率/% |
| 空白 | 6.93±0.06 | |
| 對照 | 4.60±0.10 | 33.6 |
| 酸性蛋白酶 | 5.40±0.14 | 22.1 |
| 中性蛋白酶 | 4.83±0.06 | 30.3 |
注：空白表示培養(yǎng)基中不加發(fā)酵液，對照表示培養(yǎng)基中加發(fā)酵液。
2.3.5常溫穩(wěn)定性
由圖5可以看出，隨著時間的增加，植物乳桿菌Bx6-2的抑菌活性有不同程度的下降。在常溫下放置10d后，植物乳桿菌Bx6-2發(fā)酵液的抑菌活性仍保留在70%以上。放置15d以上，抑菌活性明顯下降，僅能達(dá)到原抑菌活性的20%左右。由此可見，植物乳桿菌Bx6-2產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在常溫下一定時間范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。
3結(jié)論
植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌有抑制作用，而且隨著發(fā)酵液濃度的增加其抑菌效果也增加。通過對發(fā)酵液性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，該菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對熱的穩(wěn)定性較好，在60℃水浴中加熱10 min后，相對抑菌活性仍在65%以上。pH、蛋白酶類對其抑菌效果均有不同程度的影響。當(dāng)pH為6.0時，抑菌效果達(dá)到最好，在過酸和堿性環(huán)境中其抑菌效果明顯降低。而植物乳桿菌Bx6-2產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對酸性蛋白酶的敏感程度比對中性蛋白酶高。在常溫下放置10d后，植物乳桿菌Bx6-2發(fā)酵液的抑菌活性仍保留在70%以上，說明在常溫下一定時間范圍內(nèi)其抑菌活性穩(wěn)定。同時還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中乳酸并不起抑菌作用。
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