?微生物農藥之綠僵菌（Metarhizium anisopliae）計數及登記
綠僵菌屬于球殼菌目麥角菌科，是一類昆蟲病原絲狀真菌，最早由Metschnikoff于1879年發現并命名。其菌落初期呈白色茸狀，產孢階段中央形成綠色至灰黑色的分生孢子堆，基質反面呈淡褐色或赭色。分生孢子單細胞、鏈狀排列，形態為長橢圓形或圓柱形（3.0-5.0μm×1.0-2.0μm），與白僵菌的球形孢子顯著不同。
綠僵菌屬包含12個種，其中農業應用最廣泛的是金龜子綠僵菌（M.anisopliae）、黃綠綠僵菌（M.flavoviride）、平沙綠僵菌（M.pingshaense）等。其最適生長溫度為24-26℃（10-30℃均可發育），最適pH 6.9-7.4，耐受pH 4.7-10。分生孢子在干燥條件下可保存3年以上，但60℃高溫會迅速失活。
作為重要的生物防治資源，綠僵菌通過侵染害蟲體壁實現殺蟲效果，對鱗翅目、鞘翅目等700余種農業害蟲具有廣譜活性，且對人畜低毒、環境友好，是替代化學農藥的關鍵微生物資源。
綠僵菌生物農藥的檢驗檢測方法
1.鑒別方法
形態學鑒定：
菌落特征：觀察橄欖綠色孢子層及鏈狀孢子排列。
顯微特征：光學顯微鏡下（400×/1000×）確認分生孢子形態（橢圓形/圓柱形）及鏈狀排列模式（區別于白僵菌的球形孢子）。
分子生物學鑒定：
ITS序列分析：通過內轉錄間隔區（ITS1-5.8S-ITS2）序列比對區分種間差異。
EF1-α基因測序：延伸因子1-α基因（EF1-α）用于菌株級分類。
PCR分子標記：檢測特異性基因片段（如tekh*基因）。
質譜分析：
MALDI-TOF MS：通過蛋白質指紋圖譜快速鑒定菌株特征。
2.效價測試
活孢子數測定（稀釋涂布平板法）：
1.樣品制備：取10g（或10mL）制劑加入90mL無菌0.05%吐溫-80鹽水，振蕩30min制成10?1懸液。
2.梯度稀釋：依次稀釋至10??、10??、10??梯度。
3.培養計數：取0.1mL稀釋液涂布PDA平板，25-28℃避光培養3-5d，選取菌落數30-300的平板計數。
4.計算公式：活孢子數（CFU/g/mL）=平板平均菌落數×稀釋倍數×10（0.1mL換算系數）。
孢子萌發率檢測（載玻片培養法）：
1.懸液制備：調整孢子濃度至1×10?-1×10?CFU/mL。
2.培養觀察：5μL懸液滴加至SDAY培養基載玻片上，25-28℃培養24-48h。
3.萌發判定：顯微鏡下統計“芽管長度＞孢子直徑1/2”的萌發孢子占比，計算萌發率（%）=（萌發孢子數/總孢子數）×100%。
生物活性測定：
靶標害蟲毒力實驗：通過浸漬法或噴霧法處理害蟲（如番茄潛葉蛾），測定半致死濃度（LC??）和半致死時間（LT??）。
3.質量控制
雜菌檢測：參照GB/T 19567.2-2023，營養瓊脂培養48h后統計非目標菌落數（污染率≤1%）。
理化指標：pH值（6.0-7.5）、水分含量（粉劑＜8%）、懸浮率（≥70%）。
安全性評估：對非靶標生物（如天敵昆蟲）及環境無顯著負面影響。
登記查詢
中國
在中國，綠僵菌屬于微生物農藥，需經農業農村部農藥檢定所登記。已有多種商品化制劑（如綠僵菌可濕性粉劑、懸浮劑等）獲得農藥登記證，用于防治蝗蟲、白蟻等：其中：
針對蝗蟲的登記制劑（如200億CFU/g可濕性粉劑）主要用于內蒙古、新疆等草原蝗區的防治，年應用面積超過1000萬畝；
針對白蟻的登記制劑（如100億CFU/mL懸浮劑）廣泛應用于房屋建筑、園林樹木的白蟻防治，替代傳統的化學殺蟲劑（如氯菊酯）；
針對蠐螬的登記制劑（如300億CFU/g微膠囊劑）在東北玉米產區、華北花生產區的應用面積逐年擴大，2023年應用面積超過500萬畝。
歐盟
歐盟對微生物農藥的管理由歐盟農藥法規(Regulation(EC)No 1107/2009)管轄。Metarhizium anisopliae特定菌株（如Metarhizium anisopliae var.anisopliae BIPESCO 5/F52）已被列入歐盟批準清單，可作為活性物質使用。
美國
在美國，綠僵菌制劑由EPA管理，歸類為生物農藥（Biopesticides）。部分菌株（如Metarhizium anisopliae strain F52）已獲EPA登記，用于農田害蟲與草坪害蟲的防治,以下是具體信息：
草坪害蟲防治：strain F52制劑用于防治高爾夫球場、公園草坪的蠐螬（如日本金龜子幼蟲），施藥后防效可達80%以上，且對草坪草無藥害；
有機農業防治：strain ARSEF 3244制劑獲得美國農業部（USDA）的“有機認證”，可用于有機蔬菜（如lettuce、spinach）、有機水果（如草莓、藍莓）的蚜蟲、薊馬防治；
公共衛生防治：部分菌株的制劑用于防治城市公園、居民區的蚊子幼蟲，替代化學殺蟲劑（如吡蟲啉），減少對水體生態的破壞。
以上方法遵循《綠僵菌、白僵菌生物農藥檢驗操作規程》（SN/T 2374-2009）及NY/T 1153.6-2013標準，確保產品質量與田間防效。
相關新聞推薦
1、?梅花鹿源A型產氣莢膜梭菌的分離鑒定、測序、毒素型、生化、耐藥性分析（一）
2、鯖魚生物胺產生菌篩選、菌落總數、生長曲線測定——摘要、材料與方法