快速藥物敏感性檢測(cè)：熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯稀釋法的對(duì)比分析（一）
摘要：目的通過(guò)熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯稀釋法對(duì)質(zhì)控菌株和臨床收集菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)進(jìn)行測(cè)定,探討熒光素酶生物發(fā)光法在病原微生物快速藥物敏感性試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。方法以D-熒光素鈉、Mg2+、O2和待測(cè)菌株為熒光素酶催化反應(yīng)底物,連續(xù)檢測(cè)待測(cè)菌與抗生素孵育過(guò)程中相對(duì)光強(qiáng)度(relative light unit,RLU)變化,計(jì)算發(fā)光率并確定MIC,分析與微量肉湯稀釋法的基本一致性(essential agreement,EA)和分類一致性(categorical agreement,CA)。結(jié)果熒光素酶生物發(fā)光法快速檢測(cè)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等質(zhì)控菌株MIC與微量肉湯稀釋法檢測(cè)MIC結(jié)果CA和EA值均為100%;并應(yīng)用該檢測(cè)體系對(duì)91株臨床革蘭陰性菌樣本、93株革蘭陽(yáng)性菌樣本進(jìn)行MIC測(cè)定,革蘭陰性菌檢測(cè)結(jié)果中的6種藥物EA和CA分別大于90%和84%,革蘭陽(yáng)性菌檢測(cè)結(jié)果中的6種藥物EA和CA分別大于90%和80%,并使檢測(cè)周期由常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)的16~24 h縮短至5~6 h。結(jié)論熒光素酶生物發(fā)光法快速檢測(cè)藥敏結(jié)果與微量肉湯稀釋法結(jié)果具有較高一致性,且更快速、敏感,可為今后的臨床檢驗(yàn)工作提供全新的快速藥敏檢測(cè)方法。
病原菌生物藥敏試驗(yàn)結(jié)果是臨床醫(yī)師治療細(xì)菌性感染、合理選用藥物、提高療效和避免濫用抗菌藥物的重要依據(jù)。然而，由于抗生素耐藥性的普遍產(chǎn)生，在2017年造成20000例細(xì)菌感染患者死于細(xì)菌耐藥性。因此，必須加強(qiáng)病原菌對(duì)藥物的敏感性檢測(cè)，及時(shí)準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)細(xì)菌對(duì)藥物敏感性和耐藥性的改變。目前臨床普遍采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的擴(kuò)散法和稀釋法，但這兩種方法的共同缺陷是測(cè)定結(jié)果所需時(shí)間長(zhǎng)，一般需約24~72 h。而對(duì)于感染性疾病的針對(duì)性治療措施開(kāi)展越早，對(duì)感染的控制效果也愈好。因此，建立1種快速藥物敏感試驗(yàn)方法無(wú)論在臨床疾病治療，或是對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查都非常必要。
熒光素酶(lucierase)是自然界中能催化熒光氧化并產(chǎn)生生物光的一類酶的統(tǒng)稱。1947年，McElory發(fā)現(xiàn)螢火蟲(chóng)發(fā)光的必不可少的底物是腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，利用提取液得到熒光素酶。1985年，de Wet等又成功高效表達(dá)系統(tǒng)完整表達(dá)了北美螢火蟲(chóng)熒光素酶基因。在熒光素酶催化發(fā)光體系中，當(dāng)熒光素等其它底物過(guò)量時(shí)，催化產(chǎn)生的相對(duì)熒光強(qiáng)度RLU與游離的ATP含量成正相關(guān)。而微生物胞內(nèi)ATP含量相對(duì)穩(wěn)定，在與青霉素、頭孢類等抗生素作用后，細(xì)胞壁合成中間轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合而抑制肽聚糖的交聯(lián)，致使細(xì)胞壁合成受阻，胞外水分進(jìn)入菌體引起細(xì)胞腫脹、變形，最后破裂溶解而死亡。細(xì)胞破壞后，細(xì)胞中的ATP會(huì)完全釋放出來(lái)，根據(jù)上述方法可以通過(guò)測(cè)量ATP的含量間接評(píng)估細(xì)菌的數(shù)量或細(xì)胞完整性，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。因此，本研究基于熒光素酶生物發(fā)光法建立快速耐藥菌藥物敏感性檢測(cè)體系，并將檢測(cè)結(jié)果與肉湯稀釋法進(jìn)行對(duì)比分析，確定熒光MIC，可克服常規(guī)檢測(cè)周期較長(zhǎng)、檢測(cè)滯后性的缺點(diǎn)，及時(shí)指導(dǎo)臨床抗感染治療精準(zhǔn)用藥。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)菌株
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)ATCC29212、大腸埃希菌(Escherichia coli)ATCC29292、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。臨床驗(yàn)證菌株收集于鄭州市中心醫(yī)院臨床樣本，包括革蘭陰性菌91株、革蘭陽(yáng)性菌93株。
1.2儀器與試劑
化學(xué)發(fā)光免疫分析儀LUMO(鄭州安圖試驗(yàn)儀器有限公司)，Mueller-Hinton Broth培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)，ATP標(biāo)準(zhǔn)品(Roche公司)，熒光素酶、D-熒光素鈉鹽(上海源葉生物科技有限公司)，Mueller-Hinton肉湯(Oxoid公司)，頭孢西丁、呋喃妥因、利奈唑胺、慶大霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、美羅培南、環(huán)丙沙星、妥布霉素、阿米卡星、頭孢噻肟和頭孢他啶(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)。
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