快速藥物敏感性檢測：熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯稀釋法的對比分析（二）
1.3方法
1.3.1熒光法快速藥敏質(zhì)控菌驗證
分別挑取37℃生長18~20 h的金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC29292、銅綠假單胞菌ATCC27853，使用無菌0.85%生理鹽水制成1.5×10^8 CFU/mL菌懸液，并按比例配制100μL反應(yīng)體系(包含1×10^4 CFU菌懸液35μL、反應(yīng)液25μL、Mueller-Hinton肉湯94μL)，每間隔1 h使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀LUMO進(jìn)行RLU測定并繪制熒光曲線。其中反應(yīng)液為自配熒光素酶催化混合液，具體配方為使用緩沖液(HEPES 47.6 mg/mL、EDTA 8.5 mg/mL、MgCl?·6H?O 4.0 mg/mL，調(diào)整pH至7.5)配制D-熒光素鈉鹽溶液(1.5 mg/mL)，測試前添加3 mg/mL熒光素酶凍干粉，充分溶解后即為反應(yīng)液。
1.3.2臨床菌株熒光法快速藥敏測試
使用0.85%生理鹽水配制0.5 McF濁度的質(zhì)控菌和臨床分離的184株革蘭陽性、陰性菌株菌懸液，Mueller-Hinton肉湯及包含2倍稀釋梯度的藥物濃度：包括頭孢西丁(16~0.5)μg/mL，萬古霉素(32~0.12)μg/mL，頭孢噻肟(28~4)μg/mL，利奈唑胺(8~0.25)μg/mL，美羅培南(16~0.03)μg/mL，環(huán)丙沙星(4~0.03)μg/mL，妥布霉素(16~0.12)μg/mL，阿米卡星(64~0.25)μg/mL，慶大霉素(16~0.12)μg/mL，紅霉素(8~0.03)μg/mL，頭孢噻肟(64~0.5)μg/mL，頭孢他啶(32~0.06)μg/mL，配制反應(yīng)體系后放于(35±2)℃溫箱進(jìn)行孵育培養(yǎng)，每間隔1 h進(jìn)行RLU測定，繪制不同時間熒光變化曲線；同時參照CLSI M100文件進(jìn)行微量肉湯對比測試確定各抗菌藥物MIC。
2結(jié)果
2.1熒光法快速藥敏質(zhì)控菌驗證
將4株革蘭陰性、革蘭陽性藥敏質(zhì)控菌與熒光素酶催化混合液共同孵育后，獲得RLU值變化曲線(圖1)。由圖知孵育前1 h內(nèi)，由于金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC29292和銅綠假單胞菌ATCC27853延遲延長期的影響，導(dǎo)致RLU出現(xiàn)自然衰減，至延長延遲延長期后出現(xiàn)連續(xù)上升。其中銅綠假單胞菌ATCC27853為專性需氧菌，生長緩慢延遲期較長，培養(yǎng)至5 h后RLU值出現(xiàn)升高，細(xì)菌開始增殖，代謝活性增強(qiáng)。糞腸球菌ATCC29212生長延遲期較短，代謝旺盛，未發(fā)現(xiàn)RLU值明顯衰減。
圖1孵育過程中質(zhì)控菌熒光曲線
2.2質(zhì)控菌熒光法藥敏結(jié)果
熒光素酶生物發(fā)光法快速檢測質(zhì)控菌-抗生素作用熒光曲線共發(fā)現(xiàn)2種類型：①生長依賴型(圖2)，即抗生素抑制細(xì)菌生長過程中，熒光素酶催化底物ATP來源于細(xì)菌生長且不被破壞中釋放，產(chǎn)生發(fā)光，計算發(fā)光率[發(fā)光率=(不加抗生素后RLU值-加抗生素后RLU值)/不加抗生素后RLU值×100%]，當(dāng)發(fā)光率≤90%時為耐藥，≥90%時為敏感；②死亡依賴型(圖3)，即抗生素抑制細(xì)胞壁的合成而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膨脹破裂死亡釋放ATP，并產(chǎn)生發(fā)光，計算發(fā)光[發(fā)光率=(加抗生素RLU值-不加抗生素RLU值)/不加抗生素后RLU值×100%]，當(dāng)發(fā)光率≤100%時為耐藥，當(dāng)100%為敏感。在對質(zhì)控菌進(jìn)行熒光法微量肉湯和微量肉湯稀釋法對比檢測MIC實驗結(jié)果中，根據(jù)熒光曲線特征定義MIC值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法檢測的革蘭陽性菌和革
圖2金黃色葡萄球菌-利奈唑胺作用熒光曲線
圖3銅綠假單胞菌-頭孢他啶作用熒光曲線
蘭陰性菌MIC的EA與CA均為100%(表1-2)，且均在質(zhì)控范圍內(nèi)。另外，常規(guī)微量肉湯稀釋法的檢測周期為16~24 h，熒光微量肉湯法藥敏實驗對4株質(zhì)控菌的檢測周期為5~6 h，檢測周期大幅，縮短結(jié)果讀出更加直觀簡便。
| 抗菌藥物 | 大腸埃希菌ATCC29292 | 質(zhì)控范圍 | 銅綠假單胞菌ATCC27853 | 質(zhì)控范圍 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 熒光法 | 微量肉湯 | 熒光法 | 微量肉湯 | |||
| 頭孢他啶 | 0.25 | 0.25 | 0.06-0.5 | 2 | 2 | 1-4 |
| 環(huán)丙沙星 | 0.008 | 0.008 | 0.004-0.016 | 0.5 | 0.5 | 0.12-1 |
| 美羅培南 | 0.05 | 0.05 | 0.008-0.06 | 0.5 | 0.5 | 0.25-1 |
| 妥布霉素 | 0.15 | 1 | 0.03-0.12 | 8 | 16 | 8-32 |
| 頭孢噻肟 | 0.06 | 0.125 | 0.05-4 | 1 | 2 | 1-4 |
| 阿米卡星 | 1 | 1 | ||||
表2 革蘭陽性質(zhì)控菌藥敏檢測結(jié)果(μg/mL)
| 抗菌藥物 | 金黃色葡萄球菌ATCC29213 | 質(zhì)控范圍 | 糞腸球菌ATCC29212 | 質(zhì)控范圍 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 熒光法 | 微量肉湯 | 熒光法 | 微量肉湯 | |||
| 頭孢西丁 | 2 | 4 | 1-4 | 7 | 7 | 7 |
| 慶大霉素 | 0.25 | 0.5 | 0.12-1 | 8 | 16 | 4-16 |
| 萬古霉素 | 1 | 1 | 0.5-2 | 1 | 2 | 1-4 |
| 紅霉素 | 0.25 | 0.5 | 0.25-1 | 16 | 16 | 1-4 |
| 利奈唑胺 | 16 | 16 | 8-32 | 2 | 2 | 1-4 |
| 注：“7”代表該質(zhì)控菌無法抵抗該抗生素。 | ||||||
2.3臨床菌熒光法藥敏結(jié)果
臨床樣本分離得到的93株革蘭陽性菌和91株革蘭陰性菌分別應(yīng)用熒光素酶生物發(fā)光法和微量肉湯法進(jìn)行藥物敏感性測定。根據(jù)對應(yīng)的熒光曲線拐點特征定義MIC值并統(tǒng)計EA和CA值(EA：基本一致性，被測系統(tǒng)MIC值與參考方法或?qū)Ρ确椒∕IC值相差不超過1個對稀釋梯度的一致性；CA：分類一致性，被評估的藥敏方法與參考方法或?qū)Ρ确椒ㄏ啾龋袛嘟Y(jié)果為敏感、中介、耐藥依賴敏感和耐藥的一致性，可接受標(biāo)準(zhǔn)：EA≥90%，CA≥90%)。結(jié)果表明金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌等革蘭陽性菌，共558個藥敏對比實驗，其中頭孢西丁、慶大霉素、紅霉素、萬古霉素和利奈唑胺共5種抗生素的EA和CA值均大于90%，但呋喃妥因表現(xiàn)出較低的分類一致性(84.81%)。此外，糞腸球菌對利奈唑胺EA值較低，僅為66.67%(表3)；大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、奇異變形桿菌等革蘭陰性菌，共546個藥敏對比實驗，測試6種抗生素的EA和CA值對均均大于90%，但大腸埃希菌、銅綠假單胞菌整體體內(nèi)MIC值較低，可分別為85.70%和81.25%(表4)，且每組測試均在6h內(nèi)繪制熒光曲線，較常規(guī)藥敏實驗大幅縮短了檢測周期。
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