快速藥物敏感性檢測：熒光素酶生物發光法與微量肉湯稀釋法的對比分析（三）
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在臨床抗感染治療過程中，藥敏實驗可以相對快速有效地檢測病原菌對各種抗菌藥物的敏感性，來指導臨床合理用藥，以實現精準治療。臨床常規藥敏試驗包括紙片瓊脂擴散法(K-B法)、稀釋法(包括肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法)、E-test法、Vitek、Microscan、PHOENIXTM System、AST等自動化藥敏分析儀，但都需要較長的孵育時間或高緊密性儀器，從而延遲致病菌感染的有效治療。ATP是生物體內能量轉換最基本的載體，同時也是螢火蟲熒光素酶催化發光產生熒光的條件之一，活菌體內ATP水平處于相對穩定的動態平衡，其含量可以作為細菌生長及細菌計數的指標。鐘敏等建立了熒光素酶催化反應快速測定結核分枝桿菌藥敏結果的試驗方法，在(6.6±2.1)d內獲得的藥敏結果與羅氏培養法符合率為95.2%。為適應臨床治療的迫切性，本研究基于熒光素酶催化反應和自動化儀器試驗進行優化，相比于傳統培養對微量肉湯法藥敏時縮短至6 h內，利用熒光素酶反應體系和細菌生長繁殖或裂解后釋放出的ATP反應發射熒光，可直接、準確測定MIC，可為臨床醫生提供及時的用藥方案，有效降低患者感染死亡率。
| 革蘭陽性菌 | 例數/株 | 頭孢西丁% | 慶大霉素% | 紅霉素% | 萬古霉素% | 呋喃妥因% | 利奈唑胺% | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | ||
| 金黃色葡萄球菌 | 18 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 83.33 | 83.33 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 88.89 | 94.44 | 100.00 |
| 表皮葡萄球菌 | 18 | 94.44 | 88.89 | 100.00 | 100.00 | 94.44 | 94.44 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 88.89 | 93.30 | 94.44 |
| 糞腸球菌 | 22 | 100.00 | / | 95.45 | / | 95.45 | 95.20 | 100.00 | 100.00 | 90.00 | 66.67 | 100.00 | 95.50 |
| 屎腸球菌 | 21 | 100.00 | / | 95.23 | / | 95.24 | 83.71 | 50.08 | 100.00 | 100.00 | 68.24 | 100.00 | 100.00 |
| 肺炎鏈球菌 | 14 | 90.00 | / | 93.75 | / | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | / | 78.75 | 100.00 | |
| 總計 | 93 | 97.39 | 94.44 | 96.29 | 100.00 | 93.54 | 93.04 | 97.85 | 100.00 | 97.35 | 84.81 | 92.97 | 90.32 |
| 注：“/”代表該藥敏無試驗數據 | |||||||||||||
本研究利用熒光素酶生物發光法對大腸埃希菌ATCC29292、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212與篩選的抗生素相互作用產生熒光，建立反應體系及發光曲線模型，根據熒光折點定義MIC。經檢測發現熒光素酶生物發光法檢測上述菌株對10抗生素的MIC與微量肉湯藥敏實驗結果一致性為100%。為進一步驗證該方法的可行性及準確性，篩選了184株臨床分離菌株，包含金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和屎腸球菌等在內的93株革蘭陽性菌，和包含大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、奇異變形桿菌等91株革蘭陰性菌，其中革蘭陽性菌熒光素酶生物發光法與微量肉湯肉湯對比EA和CA值有較高的符合率，但呋喃妥因對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌出現較低的分類結果，可能由于呋喃妥因腸球菌類抗菌藥，其作用機制為干擾細菌體內氧化還原酶系統，其氧化還原能力與ATP含量無強相關性影響。
利奈唑胺為惡唑烷酮類抗生素，通過作用于細菌50s核糖體亞單位抑制蛋白質的合成，在與糞腸球菌作用中表現出較低的CA值(僅為66.67%)，可能與利奈唑胺抑菌生長作用相關，需忽略部分熒光信號。
革蘭陰性菌對比EA和CA值分別大于90%和80%，其中假單胞菌屬為專性需氧菌，培養前期生長緩慢延遲期較長，需適當延長孵育時間，減少假陰性孔的產生。同時有研究表明部分抗生素作用細菌可伴隨快速生長(relative rapid growth，RRG)，如環丙沙星和苯唑西林；和相對低速生長(relative slow growth，RSG)，如紅霉素和利奈唑胺。RRG和RSG現象可導致依賴檢測生物量或次級代謝產物原理的快速藥物敏感性測試方法(如熒光素酶生物發光法)對部分濃度的抗生素孔出現假陽或假陰的判斷，降低測試符合率，但可通過延長孵育時間或修正對應抗生素的判讀規則進行改正。
綜上所述，該研究認為熒光素酶生物發光法主要通過檢測熒光折點判斷MIC，可實現連續監測并具有良好的準確性，判讀更直接客觀、耗時短等優點，可為臨床檢測病原菌快速、精準選擇抗生素治療提供依據。
| 革蘭陰性菌 | 例數/株 | 美羅培南% | 環丙沙星% | 妥布霉素% | 阿米卡星% | 頭孢他啶% | 頭孢噻肟% | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | ||
| 大腸埃希菌 | 15 | 93.33 | 93.33 | 93.33 | 83.70 | 92.85 | 92.85 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 92.85 | 93.33 |
| 鮑曼不動桿菌 | 14 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 92.85 | 92.85 | 100.00 | 92.85 | 92.85 | 92.85 | 100.00 | 100.00 |
| 奇異變形桿菌 | 14 | 92.85 | 97.75 | 93.00 | 93.50 | 93.00 | 93.00 | 100.00 | 100.00 | 93.75 | 93.70 | 93.75 | 100.00 |
| 陰溝腸桿菌 | 16 | 100.00 | 97.95 | 93.75 | 91.25 | 93.00 | 93.00 | 100.00 | 100.00 | 93.75 | 93.75 | 100.00 | |
| 銅綠假單胞菌 | 16 | 93.75 | 100.00 | 93.75 | 91.25 | 96.70 | 96.70 | 100.00 | 93.80 | 90.00 | 90.00 | 93.75 | 97.85 |
| 總計 | 91 | 95.60 | 96.90 | 95.70 | 93.70 | 96.00 | 96.00 | 100.00 | 98.00 | 96.70 | 96.70 | 94.50 | 97.80 |