清開靈注射液對金葡菌生長代謝的抑制作用（二）
摘要:通過研究清開靈注射液對金葡菌生長代謝的影響，探索建立基于生物活性圖譜的清開靈注射液的質量評價方法。本研究采用微量量熱法，考察藥物作用于金葡菌的生物熱效應;對所測得的熱輸出曲線進行擬合，獲得系列熱動力學參數，對比分析各項熱動力學參數及熱輸出曲線。結果顯示，在一定范圍內(0~5.00%)，隨清開靈劑量增加，金葡菌生長曲線呈“下降”趨勢且指數生長期后延;其熱動力學參數T1、T2、k1、P1、P2、I均與清開靈劑量呈現線性關系。清開靈注射液對金葡菌的半數抑菌量為3.26%，最佳抑菌量為5.47%;各類不同的清開靈注射液樣品作用下的金葡菌生長曲線存在不同程度差異。實驗結果表明，清開靈注射液對金葡菌生長具有較強的抑制作用，通過微量量熱法研究，可對清開靈注射液的質量一致性進行初步評價。
清開靈注射液是傳統名方“安宮牛黃丸”的改良劑型，由膽酸、珍珠母(粉)、豬去氧膽酸、梔子、水牛角(粉)、板藍根、黃芩苷、金銀花8味中藥組成，成分復雜。清開靈主要用于熱病、神昏、中風偏癱、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、腦血栓形成、腦出血等。但是，隨著清開靈注射液臨床應用日益廣泛，其引發的不良反應也時有報道。盡管目前針對清開靈注射劑質量評價也發展了許多基于化學成分的方法，但由于未直接與生物活性相關聯，目前尚無有效控制質量一致性與穩定性的方法進入實際應用。
目前，在中藥質量控制與評價研究中，生物評價已成為發展方向與熱點之一。國家食品藥品監督管理局(SFDA)針對已上市的中藥注射劑明確要求:“建立生物活性檢測方法，以彌補目前檢驗指標僅僅能控制已知成分的不足，從生物活性角度控制藥品的質量?！痹谧⑸湟嘿|量評價體系中引入生物評價方法具有其研究前景?，F代藥理研究表明，清開靈注射液主要有解熱鎮靜、抗菌、治療腦缺血、抗凝促溶、免疫調節等作用。臨床上，清開靈注射液常用于熱病、急性上呼吸道感染及肺炎等，這與清開靈注射液具有良好的抗菌作用密不可分。微量量熱法，作為一種快速非侵入性的方法，近年來被廣泛應用于對物質抗菌能力的考察。結合課題組前期研究工作，本文采用微量量熱法考察清開靈注射液對金葡菌生長代謝行為的影響，并對其抑菌作用參數進行比較和評價。
材料與方法
儀器:LKB-2277生物熱活性檢測系統,LKB-2132蠕動泵(瑞典Thermometric公司)。
藥品與試劑:清開靈注射液樣品共6批，由具代表性的兩大生產廠家(BZY、SXTH)提供，各提供3批,樣品批號分別為:811601、712604A、710510A和070930、071120、071219。
實驗材料:金葡菌Staphylococcus aureus(武漢大學中國典型培養物保藏中心,CCTCC AB910393)。
培養基配制:LB培養基:取蛋白胨胨10.0 g,酵母粉5.0 g,氯化鈉5.0 g,加蒸餾水至1 L,調節pH至7.0~7.2,分裝后于121°C高壓蒸氣滅菌20 min,置4°C備用。
生長熱功率輸出曲線采集:采用停流法檢測。系統溫度設定為37℃，測定前分別用適量0.1mol·L氫氧化鈉、0.1mol·L-鹽酸、75%乙醇溶液和無菌水清洗管道和流通池，待儀器獲得穩定基線后，用蠕動泵以50mL·h-l的流速，將菌液和清開靈注射液混合液泵入微量量熱儀中;當樣品充滿流通池后停泵，啟動采集卡開始采集數據，跟蹤記錄流通池內細菌生長的產熱曲線(P-t曲線)，當產熱曲線數據重新回到基線后，實驗結束。
樣品對金葡菌生長代謝影響測定:根據實驗設計，將一定量的清開靈注射液加入到接種了金葡菌的培養液中，使最終菌懸液菌濃度為2x106CFU·mL-1振蕩混勻，以備進樣。整個過程為無菌操作。
結果
1金葡菌的生長熱功率輸出曲線
圖1是37℃下，停流法測定的金葡菌完整代謝曲線。曲線a(P-t曲線)是所測定的細菌生長曲線，可以分成4個階段:I停滯期、II指數生長期、III穩定期和IV衰亡期。分別對應于細菌對培養基中不同營養成分的利用情況及不同的代謝過程，與傳統方法測定的細菌代謝曲線相似。曲線b(lnP-t曲線)則顯示了線性擬合后細菌代謝熱功率輸出隨時間的變化特征。
根據微生物生長代謝的特征和化學動力學、熱動力學原理,建立了多種基于細菌細胞的熱動力學模型,其中以指數模型最為常用。根據細菌生長指數模型,在細菌生長過程中的指數生長期,其產熱功率Pt與生長速率常數k有如下關系:
Pt=P0exp(k t)或ln Pt=ln P0+k t
式(1)中的Pt就是產熱曲線中指數生長期內t時刻的輸出熱功率,將圖譜的指數生長期Pt、t值代入公式(1)中，進行線性擬合可得金葡菌的生長速率常數k值。