畢赤酵母植酸酶發酵工藝優化：比生長速率多少時甲醇流加補料效果最為理想？
植酸酶作為一種高效的飼料添加劑，在動物體內可以幫助其降解植酸鹽，改善磷和其他養分的消化吸收，減少養分排泄，提高磷的利用率，增加養殖戶的經濟效益，同時對降低植酸磷對環境的污染有重要作用。目前，養殖業對植酸酶的需求越來越大，同時更加關注其成本。因此，提高植酸酶表達量，降低發酵成本成為植酸酶研究、生產的當務之急。
畢赤酵母植酸酶發酵工藝優化的研究已有很多報道。李洪淼等對巴斯德畢赤酵母的高密度發酵條件進行了實驗，并根據搖瓶發酵的優化結果進行了補料方式的研究。黃魁英等[2]對植酸酶畢赤酵母基因工程菌PEY-2的發酵條件進行了研究。郭美錦等對重組畢赤酵母表達工程植酸酶過渡相參數進行了分析研究。閔兆升等采用單因素試驗和正交試驗考察了不同工藝條件對畢赤酵母工程菌H311產植酸酶的影響。王興吉等對畢赤酵母H工程菌30 L發酵產植酸酶的發酵條件及該酶的熱穩定性進行了研究。
1研究方法
1.1實驗材料
1.1.1菌株
重組畢赤酵母基因工程菌(Mut+)，由本公司自行構建，分泌表達植酸酶。
1.1.2培養基
種子培養基為酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養基，發酵培養基為基礎鹽(BSM)培養基(用葡萄糖替換甘油)。
1.2方法
1.2.1種子培養
將保藏菌種接種到50 mL的YPD培養基中培養18～24 h，再按照10%接種量接種YPD培養基擴培16～24 h，然后按照8%接種量接入發酵罐BSM培養基中發酵培養。
1.2.2發酵控制
流加氨水控制pH 4.5，底糖耗盡后通過流加含12 mL/L微量鹽(PTM1)培養基的60%的葡萄糖增加濕重，控制相同濕重(180 g/L左右)開始誘導，根據實驗需求和測量的濕重控制不同比生長速率(μ)0.01 h-1、0.015 h-1、0.02 h-1進行相應的甲醇補料誘導植酸酶表達。每隔8 h或16 h取樣測濕重，然后調節甲醇補料量為濕重與比生長速率乘積。
1.2.3分析方法
細胞濕重測定：10 mL發酵液10 000 r/min離心10 min后棄上清稱重；植酸酶酶活測定：GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測定分光光度法[12]。
2結果與討論
2.1對照實驗
發酵液底料中含有30 g/L葡萄糖，葡萄糖耗盡之后DO回升，此時開始流加60%的葡萄糖直至誘導所需濕重180 g/L(大約發酵時間24 h時)，之后停止流加葡萄糖，饑餓30 min左右，開始流加甲醇誘導產酶。對照組甲醇流加策略參照Invitrogen畢赤酵母發酵手冊[13]進行控制，速度從1 g/(L·h)開始，每兩小時提高0.5 g/(L·h)，直到甲醇流加速度為4.5 g/(L·h)時，停止繼續提高，并以該流速至發酵結束。
由圖1可知，發酵40 h時(大約誘導后15 h左右)，濕重186 g/L，酶活691 U/mL，隨后酶活和濕重隨發酵時間增加，發酵144 h時濕重出現輕微下降，最后兩個取樣點酶活基本相同，至發酵168 h時下罐，此時濕重408 g/L，酶活10 282 U/mL。
圖1對照酶活濕重曲線
2.2比生長速率為0.01 h-1時的產酶狀況
甲醇誘導產酶之前的過程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，按照0.01 h-1乘以相應的濕重(每8 h或16 h取樣測濕重，然后進行相應的甲醇流速調節)所得的速度進行甲醇補料。
由圖2可知，發酵40 h時，濕重192 g/L，酶活583 U/mL，隨后酶活和濕重隨發酵時間增加，酶活168 h時出現輕微下降，至發酵168 h時下罐，此時濕重457 g/L，酶活11 763 U/mL。以0.01 h-1的比生長速率進行甲醇流加，發酵最終消耗甲醇5.3 L，而對照組甲醇消耗6.2 L，盡管甲醇消耗比對照少14.5%，但是酶活卻比對照高14.4%。
圖2比生長速率0.01 h-1時酶活濕重曲線
2.3比生長速率為0.015 h-1時的產酶狀況
甲醇誘導產酶之前的過程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，按照0.015 h-1乘以相應的濕重(每8 h或16 h取樣測濕重，然后進行相應的甲醇流速調節)所得的速度進行甲醇補料。
由圖3可知，發酵40 h時，濕重185 g/L，酶活423 U/mL，隨后酶活和濕重隨發酵時間增加，144 h時濕重出現下降，至發酵168 h時下罐，此時濕重482 g/L，酶活13 644 U/mL。以0.01 h-1和0.015 h-1的比生長速率進行甲醇補料，中前期酶活和對照相當甚至比對照低，但是隨著發酵進行，菌體濕重增大，甲醇流加量增大，最終發酵酶活都超過對照組。
圖3比生長速率0.015 h-1時酶活濕重曲線
2.4比生長速率為0.02 h-1時的產酶狀況
甲醇誘導產酶之前的過程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，之后按照0.02 h-1乘以相應的濕重(每8 h或16 h取樣測濕重，然后進行相應的甲醇流速調節)所得的速度進行甲醇補料。
由圖4可知，發酵40 h時，濕重190 g/L，酶活712 U/mL，隨后酶活和濕重隨發酵時間一直增加，至發酵168 h時下罐，此時濕重524 g/L，酶活17 445 U/mL。以0.02 h-1的比生長速率進行甲醇補料時，酶活一直比對照和其他兩個實驗組高，可以推斷前期菌體適應甲醇后，在一定范圍內，甲醇量越高對產酶越有利。而以0.02 h-1的比生長速率進行甲醇流加，最終酶活比對照提高69.7%，因此，以合適的比生長速率控制甲醇流加，可能會引起菌體代謝流的改變，更多的代謝能量和物質流向產酶通路。
圖4比生長速率0.02 h-1時酶活濕重曲線
由圖5可知，隨著底糖消耗DO逐漸降低，至16 h左右，底糖耗盡，DO回升，隨之開始補糖流加，至發酵24 h左右濕重達到180 g/L，停糖饑餓30 min，此時DO大幅回升，然后按照1 g/(L·h)的速度流加甲醇3 h，之后按照各自甲醇流加策略分別進行甲醇流加。發酵中期DO水平與甲醇流加量相關，甲醇流加量大，DO水平低，而發酵后期DO基本都跌零，但是通過對發酵液進行液相檢測，甲醇幾乎沒有殘留。
圖5不同比生長速率下的溶氧量曲線
3結論
以不同的比生長速率進行甲醇流加補料，發酵酶活均比對照提高。以0.01 h-1，0.015 h-1，0.02 h-1比生長速率進行甲醇補料，酶活分別提高14.4%，32.7%，69.7%。以比生長速率指導甲醇補料，既可以提高甲醇的利用率，又可以提高酶活力，從而降低發酵成本。受取樣時間的限制，本文根據比生長速率進行甲醇流速調整的時間間隔為8 h或16 h，如果利用可以在線檢測菌體密度的發酵反應器，根據測得的菌體密度在線實時反饋調節甲醇流量，可能會得到更優的結果。隨著比生長速率的提高，酶活提高越多，在DO允許的情況下，繼續提高比生長速率可能會更大地提高產酶量，而受反應器及DO的限制，本文得到的最適比生長速率為0.02 h-1。
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