基于微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀研發(fā)導(dǎo)管尖端的自動(dòng)化培養(yǎng)鑒定方法
留置血管內(nèi)導(dǎo)管是為患者實(shí)施診療時(shí)常用的醫(yī)療操作技術(shù)。隨著各種導(dǎo)管在臨床廣泛的應(yīng)用，導(dǎo)管相關(guān)的感染也越來(lái)越多。血管導(dǎo)管相關(guān)感染(Vessel CatheterAssociated Infection，簡(jiǎn)稱(chēng)VCAI)是指留置血管導(dǎo)管期間及拔除血管導(dǎo)管后48小時(shí)內(nèi)發(fā)生的原發(fā)性、且與其他部位感染無(wú)關(guān)的感染，包括血管導(dǎo)管相關(guān)局部感染和血流感染。目前臨床常用的導(dǎo)管的類(lèi)型包括中心靜脈導(dǎo)管、PICC、臍血管導(dǎo)管、完全植入式靜脈輸液港、血液透析導(dǎo)管、外周動(dòng)脈導(dǎo)管、漂浮式肺動(dòng)脈導(dǎo)管等。這些導(dǎo)管的植入是一種侵襲性操作，操作過(guò)程中污染，護(hù)理不當(dāng)，放置的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、菌血癥等原因都會(huì)引起導(dǎo)管相關(guān)感染。
據(jù)報(bào)道，聚氯乙烯、硅膠制品等導(dǎo)管可以粘附大量微生物，從而增加感染幾率。隨著導(dǎo)管留置時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)管在其內(nèi)的留置會(huì)使血液中的纖維蛋白及血清蛋白沉淀聚集在導(dǎo)管表面，反而起到了保護(hù)病原體的作用。綜上，病原體可沿導(dǎo)管表面向體內(nèi)蔓延生長(zhǎng)，繁殖到一定數(shù)量時(shí)釋放人血就會(huì)出現(xiàn)菌血癥、敗血癥的相關(guān)臨床癥狀，有感染導(dǎo)致休克死亡的風(fēng)險(xiǎn)。因此，及時(shí)確定是否血管導(dǎo)管相關(guān)感染并快速選擇合理有效的抗感染藥物是治療成功的關(guān)鍵。
為明確導(dǎo)管相關(guān)感染，需要進(jìn)行導(dǎo)管尖端培養(yǎng)以明確診斷，鑒別致病菌。目前常見(jiàn)的檢測(cè)方法包括以下步驟：1)用無(wú)菌剪刀剪下導(dǎo)管尖端，2)將剪下的導(dǎo)管尖端放在無(wú)菌容器中送至專(zhuān)業(yè)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，3)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將待測(cè)導(dǎo)管尖端在血平皿上作滾動(dòng)涂布接種，4)將血平皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20h，5)取出血平皿通過(guò)觀察有無(wú)菌斑來(lái)判斷該導(dǎo)管尖端外部是否被可培養(yǎng)細(xì)菌污染。如果需要檢測(cè)導(dǎo)管尖端內(nèi)部是否被污染，則需要采用超聲震蕩無(wú)菌生理鹽水沖洗導(dǎo)管尖端，然后將沖洗水涂在血平皿上接種，再進(jìn)行其它的操作步驟。目前檢測(cè)導(dǎo)管及導(dǎo)管尖端是否被病原體污染的主要問(wèn)題有四個(gè)，一是即使有細(xì)菌粘附污染，在接種時(shí)也不一定能(全部)從待測(cè)導(dǎo)管尖端上脫離并接種到血平皿上，因而易造成假陰性誤判；二是操作繁瑣，結(jié)果嚴(yán)重依賴微生物檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)操作人員的個(gè)人技能；三是周期長(zhǎng)，效率低，培養(yǎng)結(jié)果在72小時(shí)后才能反饋給臨床；這導(dǎo)致針對(duì)致病菌的針對(duì)性治療延后了至少72小時(shí)。四是致病原鑒定無(wú)法在床旁等現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施。
目前醫(yī)療行業(yè)急需簡(jiǎn)便高效、快速準(zhǔn)確檢測(cè)導(dǎo)管相關(guān)感染及床旁快速藥敏試驗(yàn)的新技術(shù)。
導(dǎo)管尖端的自動(dòng)化培養(yǎng)鑒定步驟：
步驟1：一次性檢測(cè)管中預(yù)裝入蛋白胨水，將待測(cè)導(dǎo)管尖加入到所述一次性檢測(cè)管中，將一次性檢測(cè)管封口；
步驟2：然后將一次性檢測(cè)管插入微生物生長(zhǎng)曲線自動(dòng)化測(cè)定儀器中的檢測(cè)通道；
步驟3：通過(guò)微生物生長(zhǎng)曲線自動(dòng)化測(cè)定儀器測(cè)定的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線形狀判斷目標(biāo)導(dǎo)管尖是否有細(xì)菌或真菌定植
采用八通道電容耦合非接觸式電導(dǎo)率檢測(cè)器作為傳感單元，采用一對(duì)同軸銅氣缸作為致動(dòng)器電極和拾取電極，構(gòu)成電容耦合的非接觸式電導(dǎo)率檢測(cè)器的工作通道。在將充滿含有導(dǎo)管尖的培養(yǎng)液試管插入工作通道后，將交流電壓施加到致動(dòng)器電極上，以電容耦合到水介質(zhì)中。致動(dòng)器電極和拾取電極與絕緣管和介質(zhì)形成兩個(gè)耦合電容(Cw)。損耗電容(Cs)產(chǎn)生于兩個(gè)電極通過(guò)空氣(Cs)之間的直接電容耦合。該水介質(zhì)相當(dāng)于一個(gè)電阻器接收站。介質(zhì)的表觀電導(dǎo)率(直流電壓信號(hào))在拾取電極上獲得；其大小與水介質(zhì)中離子載流子的濃度和遷移率成正比。如果導(dǎo)管尖存在細(xì)菌或者真菌，細(xì)菌或真菌細(xì)胞將在所需的溫度下增殖和生長(zhǎng)。細(xì)菌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化了不帶電或弱帶電的底物，酵母、肽和糖轉(zhuǎn)化成高電荷的最終產(chǎn)物，如氨基酸、醛、酮、酸等代謝物，提高水介質(zhì)的電導(dǎo)率。通過(guò)電容耦合的非接觸式電導(dǎo)率檢測(cè)器，每間隔30秒自動(dòng)在線收集水介質(zhì)的表觀電導(dǎo)率。由于電導(dǎo)率的變化而不是絕對(duì)值與細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程成正比，我們使用算法計(jì)算每個(gè)試管中水介質(zhì)的電導(dǎo)率變化值(即歸一化表觀電導(dǎo)率值NACV)如下：
NACVn＝ACVn-ACV0
式中，NACVn為n點(diǎn)收集的實(shí)時(shí)NACV；ACVn為n點(diǎn)收集的表觀電導(dǎo)率值；ACV0為孵育開(kāi)始時(shí)收集的初始表觀電導(dǎo)率值。然后通過(guò)繪制NACVs為孵育時(shí)間的函數(shù)來(lái)生成s型CCS生長(zhǎng)曲線。當(dāng)導(dǎo)管尖沒(méi)有任何細(xì)菌真菌時(shí)，生長(zhǎng)曲線為一條直線(沒(méi)有s型CCS生長(zhǎng)曲線)。
細(xì)菌或者真菌在生長(zhǎng)代謝的過(guò)程將分解導(dǎo)電性較差的有機(jī)大分子物質(zhì)，生成導(dǎo)電性較好的小分子物質(zhì)和離子，造成混合體系導(dǎo)電能力的增加，即混合體系電導(dǎo)C值的增加。這種電導(dǎo)的增加過(guò)程可以通過(guò)電子微生物生長(zhǎng)分析儀實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)并生成C-t曲線。從電子微生物生長(zhǎng)分析儀自動(dòng)報(bào)告的細(xì)菌生長(zhǎng)C-t曲線形狀直接讀出定性檢測(cè)結(jié)果：正峰，且電導(dǎo)率值(NACV)＆gt;0.02V，說(shuō)明目標(biāo)細(xì)菌或菌群生長(zhǎng)；水平線，說(shuō)明細(xì)菌沒(méi)有生長(zhǎng)。
快速藥敏試驗(yàn)為頭孢他啶管和頭孢他啶-克拉維酸管在培養(yǎng)45000s內(nèi)，兩管電導(dǎo)率值差值(NACV’)＆gt;0.02V。
導(dǎo)管尖端的自動(dòng)化培養(yǎng)鑒定方法工作過(guò)程為：
將從臨床送檢的導(dǎo)管尖端放置到預(yù)先裝滿蛋白胨水的專(zhuān)用檢測(cè)管中，將檢測(cè)管封口后插入電子微生物生長(zhǎng)分析儀，電子微生物生長(zhǎng)分析儀全自動(dòng)在線監(jiān)測(cè)并繪制出非接觸電導(dǎo)(C)-時(shí)間(t)曲線。從電子微生物生長(zhǎng)分析儀自動(dòng)報(bào)告的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線形狀直接讀出結(jié)果(培養(yǎng)45000s內(nèi))：電導(dǎo)率值(NACV)＆gt;0.02V，說(shuō)明導(dǎo)管尖存在細(xì)菌或真菌；電導(dǎo)率值(NACV)＆lt;0.02V或水平線，說(shuō)明沒(méi)有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)。細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程由電子微生物生長(zhǎng)分析儀全自動(dòng)在線監(jiān)測(cè)并繪制出非接觸電導(dǎo)(C)-時(shí)間(t)曲線。測(cè)定結(jié)束后根據(jù)C-t曲線的形狀及電導(dǎo)率值判斷導(dǎo)管尖是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。
測(cè)定金黃色葡萄球菌(ATCC25923)標(biāo)準(zhǔn)菌株在導(dǎo)管尖內(nèi)定植能否被檢測(cè)。
步驟一、啟動(dòng)電子微生物生長(zhǎng)分析儀(ER832型，澳大利亞eDAQ公司產(chǎn)品)和專(zhuān)用計(jì)算機(jī)。在檢測(cè)軟件窗口設(shè)置溫度、采集頻率、采集次數(shù)、激勵(lì)頻率和激勵(lì)強(qiáng)度參數(shù)分別為38℃、1分鐘/次、1200次、30KHz和80％，預(yù)熱10分鐘，待用。
步驟二、采用單通道移液器(大龍公司產(chǎn)品，量程為0-200μL)將含107
CFU/mL金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的200μL LB液體培養(yǎng)基打入導(dǎo)管尖中，將導(dǎo)管尖放入已經(jīng)預(yù)裝有2mL蛋白胨水(廣州迪景微生物科技有限公司)的一次性檢測(cè)管(青島谷峰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品，U型，材質(zhì)為聚丙烯，外徑5mm，內(nèi)徑4.5mm，管長(zhǎng)170mm)，然后采用無(wú)菌膠塞封住管口。同樣，將200μL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基打入導(dǎo)管尖中，將導(dǎo)管尖放入已經(jīng)預(yù)裝有2mL蛋白胨水的一次性檢測(cè)管并封口，作為陰性對(duì)照；
步驟三、將上述兩個(gè)檢測(cè)管分別插入電子微生物生長(zhǎng)分析儀的檢測(cè)通道，并開(kāi)始測(cè)定細(xì)菌C-t曲線。
步驟四、對(duì)應(yīng)于待測(cè)金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和陰性對(duì)照的C-t曲線如圖1所示。其中陰性對(duì)應(yīng)一條直線，說(shuō)明檢測(cè)體系未被污染。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)對(duì)應(yīng)一條正峰(即細(xì)菌生長(zhǎng)代謝且結(jié)果造成血液電導(dǎo)增加)，說(shuō)明體系中細(xì)菌能夠正常生長(zhǎng)代謝。
測(cè)定肺炎克雷伯菌(ATCC700603)標(biāo)準(zhǔn)菌株快速藥敏試驗(yàn)。
步驟一、同實(shí)施例1步驟一。
步驟二、采用單通道移液器將含肺炎克雷伯菌(ATCC700603)待測(cè)菌株107
CFU/mL200uL打入兩個(gè)導(dǎo)管尖中，將含有待測(cè)菌株的導(dǎo)管尖所在的蛋白胨水作為待測(cè)液分別加入已經(jīng)預(yù)裝含有頭孢他啶(16mg/L)、頭孢他啶-克拉維酸(16/4mg/L)的蛋白胨水中的一次性檢測(cè)管，然后采用無(wú)菌膠塞封住管口。同樣，將200μL超純水轉(zhuǎn)入一個(gè)同樣已經(jīng)預(yù)裝有蛋白胨水的檢測(cè)管并封口，作為陰性對(duì)照；頭孢他啶-克拉維酸管與頭孢他啶管比較，可初步判斷是否產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶。
步驟三、將上述三個(gè)檢測(cè)管分別插入電子微生物生長(zhǎng)分析儀的一個(gè)檢測(cè)通道，并開(kāi)始測(cè)定細(xì)菌C-t曲線。
步驟四、對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照、含有頭孢他啶(16mg/L)、頭孢他啶-克拉維酸(16/4mg/L)的蛋白胨水的C-t曲線如圖2所示。其中陰性對(duì)應(yīng)一條直線，說(shuō)明檢測(cè)體系未被污染。含有頭孢他啶(16mg/L)比頭孢他啶-克拉維酸(16/4mg/L)在培養(yǎng)45000s內(nèi)，兩管電導(dǎo)率值差值(NACV’)＆gt;0.02V。說(shuō)明體系中細(xì)菌能夠正常生長(zhǎng)代謝且產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶(即具有耐藥性)。通過(guò)是否產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶判斷細(xì)菌是否具有耐藥性。
超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBL)是一類(lèi)能水解青霉素類(lèi)，頭孢菌素類(lèi)以及單環(huán)類(lèi)抗生素的β-內(nèi)胺酶，其活性能被某些B-內(nèi)酷胺酶抑制劑抑制。能產(chǎn)生ESBL的細(xì)菌即為ESBL(+)菌，可對(duì)上述多種抗生素產(chǎn)生耐藥；
肺炎克雷伯菌為一種革蘭氏陰性桿菌，其最重要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；
頭孢他啶-克拉維酸(頭孢他啶與克拉維酸聯(lián)用)的原因：革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生的超廣譜β內(nèi)酰胺酶的活性可以被β內(nèi)酰胺酶抑制劑，比如克拉維酸所抑制。
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