工程菌大腸桿菌EcN FGF19-01培養、生長曲線測定及改善慢性結腸炎作用研究（一）
炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種特發腸道的慢性疾病，主要包括克羅恩病（Crohn disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC），目前病因尚不明確，臨床常表現為急性疼痛、腹瀉和血便等癥狀，嚴重影響患者的生活質量。近年來IBD的發病率和流行率在世界各地呈上升趨勢，目前IBD以藥物治療為主，其主要用于緩解或維持緩解癥狀，目前尚未有完全治愈的方法。
IBD臨床治療藥物主要有水楊酸類、糖皮質激素類和免疫抑制劑類。水楊酸類藥物（如5-氨基水楊酸）可通過降低腸內促炎癥因子的釋放發揮抗炎作用，臨床常用于輕度至中度癥狀的腸炎患者，但水楊酸類藥物具有較嚴重的胃腸道等不良反應，也有報道稱可能引起腎損傷；糖皮質激素類藥物（如氫化可的松、潑尼松）通過抑制致炎物質（如前列腺素、白三烯）的釋放緩解炎癥，臨床常用于中度至重度癥狀的腸炎患者，但長期或大量服用易產生耐藥性及多種不良反應；免疫抑制劑類藥物如硫唑嘌呤、腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）抑制劑，可抑制炎性細胞增殖，臨床主要用于誘導緩解或維持緩解臨床治療困難的激素依賴性克羅恩病（Crohn's disease,CD），但患者服用后容易引起惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應。總之，盡管水楊酸類藥物、激素類藥物或免疫抑制劑類藥物等能緩解IBD的臨床癥狀，但均存在停藥易復發、長期使用患者依從性低等不足。
近年來大量研究顯示，補充益生菌或工程菌在IBD的治療中取得了較好的效果，能有效緩解其臨床癥狀。益生菌憑借其固有的腸道親和力，被視為改善腸道健康的潛力候選者。然而，天然菌株在治療上的效果往往有限。合成生物學技術的興起為開發基因工程細菌提供了創新途徑，有望成為破解這些難題的新策略。大腸桿菌E.coli Nissle 1917（EcN）是自1917年發現以來已在人類中使用來治療各種胃腸道和代謝疾病，包括炎癥性腸病、腸易激綜合征和苯丙酮尿癥等。EcN菌不會在人體中定植，且人體攝入一周后糞便中即檢測不到該菌的存在，故具有良好的安全性和遺傳易處理性。而且，EcN菌已被批準使用作為底盤菌開發特異性的治療各種疾病的活菌藥物。例如，Praveschotinunt等人構建了誘導表達卷曲融合的三葉因子（TFFs）的工程化EcN，利用阿拉伯糖作為誘導劑成功促使EcN分泌TFFs，并顯著緩解了DSS誘導的結腸炎。
人成纖維細胞生長因子19(FGF19)是一種24 kDa的蛋白質，是在回腸末端特異性合成并分泌的細胞因子，屬于FGFs的特殊成員之一，與嚙齒動物體內FGF15同源；兩者的組織分布相似，有時被稱為FGF15/19。FGF19最初是在胎兒大腦中發現的，被認為在早期神經元發育中起著關鍵作用。后續在表達FGF19的轉基因小鼠發現其代謝率增加和肥胖減少現象，揭示了FGF19參與代謝調節，進一步研究發現FGF19參與膽汁酸生物合成途徑的反饋抑制。FGF15/19在回腸中響應膽汁酸的吸收而表達分泌，膽汁酸釋放至回腸結合法尼酯X受體（FXR），進而促進FGF15/19的轉錄表達；FGF19進入門靜脈循環，通過降低肝臟CYP7A1（催化膽固醇轉變為7α羥基膽固醇，膽汁酸合成的第一限速步驟）活性，從而負反饋抑制肝臟新膽汁酸合成。
研究表明，DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，回腸FGF15表達顯著下降（NatureCommunications 2014,5:4573）；接受回腸切除術的患者或克羅恩病人血清FGF19顯著降低（Journal of Crohns＆amp;Colitis 2015,9:125-31）。研究表明，小鼠敲除FGF15、FGFr4或Klb，將導致糞便中膽汁酸含量升高，誘發腹瀉（Cell Metabolism 2005,2:217-25）。腸炎狀態下腸道FXR表達顯著下降，破壞膽汁酸負反饋通路FXR-FGF19/15，補充低劑量的人重組FGF19恢復腸道膽汁酸內穩態，緩解DSS誘導的慢性腸炎的發生發展（NatureCommunications 2020,11:3612）。以上研究說明FGF19表達分泌異常及其膽汁酸合成代謝失調是慢性腸炎發生發展的關鍵因素。因此，通過基因和藥物干預或增強FGF19作用似乎是一種潛在的改善慢性結腸炎的有效手段。
1、大腸桿菌EcN的培養
利用LB（Luria-Bertani）培養基培養大腸桿菌。LB液體培養基的配制（1L）：在950mL ddH2O中加入胰化蛋白胨（tryptone）10g；酵母提取物（yeast extract）5g；NaCl 10g。用1M的NaOH調節pH值到7.0，固體培養基中額外添加15g瓊脂粉；ddH2O定容至1L。121℃，20min高壓滅菌，細菌培養全程在超凈臺中操作，大腸桿菌按照1∶100比例接種，8-12h生長至對數期，經離心收集，用含20%甘油的PBS凍存細菌。
活細菌濃度測定：細菌經37度水浴解凍，利用PBS按10倍梯度稀釋菌液，分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后將10-7和10-8的兩個濃度菌液涂布到固體培養皿中；24h之后計算菌落數目，根據稀釋倍數計算出細菌原液的活菌數。以菌落形成單位（CFU，Colony-Forming Units）表示單位體積中的細菌的群落總數。
2、表達FGF19工程化EcN的設計
細菌內源性FnrS的啟動子（PfnrS）在氧氣存在下是無活性的，但在厭氧或微氧條件下與FNR結合被激活；基于此，采用了PfnrS啟動子驅動FGF19的表達，從而使工程菌被口服灌胃后在腸道深處無氧/微氧情況下得以啟動目標基因的表達。人源FGF19基因的CDS序列經密碼子優化（E.coli Codon Usage Analyzer 2.1）后連接細菌內源ompA的信號肽序列，然后與rrnB T1終止子序列一起組成PfnrS+ompA信號肽+FGF19 CDS+rrnB T1終止子的表達框，表達框全長1020 bp核苷酸。該設計將促使工程菌在腸道內低氧環境下能夠高效表達FGF19，同時分泌至細胞外面，有效接觸作用腸道黏膜，工程菌工作模式見圖1。
3、工程化大腸桿菌EcN FGF19-01構建步驟
細菌基因編輯采用雙質粒系統（pCas,addgene#62225;pTargetF,addgene#62226）。選擇EcN基因組的exo/cea基因位點作為編輯插入區域，因為該位點被證明是安全位點，不會誘發基因毒性和不影響細菌自身生存。首先把pCas質粒通過電轉導入EcN感受態細胞，篩選陽性菌株，命名為EcN Cas9+；然后構建帶有exo/cea-sgRNA、上下同源臂和PfnrS-FGF19表達框序列的pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19重組質粒；步驟如下：利用gRNA設計網站工具（https://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html），針對EcN基因組的exo/cea基因位點序列設計得到20 bp的gRNA序列（GGAACTACATTAGGTATCTG），然后設計帶有SpeI/PstI雙酶切位點的引物exo/cea-sgRNA-F和exo/cea-sgRNA-R，以pTargetF質粒為模版，PCR擴增得到exo/cea-sgRNA序列，然后插入pTargetF質粒得到pTargetF-exo/cea-sgRNA重組質粒；委托鉑尚生物技術(上海)有限公司合成上述1020 bp PfnrS-FGF19表達框核苷酸序列；設計引物，PCR擴增exo/cea位點的上游和下游同源臂序列，命名為exo/cea-LHA、exo/cea-RHA，長度分別為1040 bp、1010 bp；通過Overlap-PCR將所述1020 bpPfnrS-FGF19表達框核苷酸序列和exo/cea-LHA、exo/cea-RHA序列進行連接，再通過BglII/XhoI雙酶切、連接插入至重組質粒pTargetF-exo/cea-sgRNA，最終得到重組質粒pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19。
進一步將重組質粒pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19電轉化至EcN Cas9+感受態菌株中；通過在LB平皿固體培養基中添加10 mM的阿拉伯糖和Spe、Kan雙抗性進行菌株篩選，陽性菌株，經過基因編輯后，然后從LB平皿中挑取單菌落；然后通過PCR鑒定陽性菌株，以及測序篩選陽性突變菌株。
最后，將得到的編輯成功的陽性菌株進行pCas和pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19質粒消除。將細菌接種至1.5 mL含有卡那霉素（50μg/mL）和IPTG（0.5 mM）的LB培養基中，孵育8-16h，然后稀釋，涂布至含有卡那霉素（50μg/mL）平板上。然后挑單克隆菌株進行PCR鑒定，篩選消除了pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19質粒的陽性菌株。最后將菌株接種至無抗性的LB培養基，37度培養過夜，然后稀釋，涂布至無抗性平板上。然后挑單克隆菌株進行PCR鑒定。最終將得到編輯成功且不帶pCas和pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19質粒的陽性工程化大腸桿菌株，并命名為EcN FGF19-01；將野生型菌株命名為EcN WT。
4、工程菌EcN FGF19-01和野生型菌株EcN WT的生長曲線測定
將EcN FGF19-01和EcN WT單克隆菌株培養在LB培養基中過夜，于第二天早上，分別按照1∶100比例接種，然后分別在0、2、4、6、8、10和12h時測定OD600值，并繪制生長曲線。結果顯示，EcN FGF19-01和EcN WT菌株生長曲線無顯著差異。
5、RNA提取及實時定量熒光PCR
總RNA抽提按照Trizol試劑（Invitrogin）說明書操作步驟進行，并用RNA純化試劑盒TURBO DNA-freeTM Kit（AM1907，Applied Biosystems）對提取的總RNA進行純化去除DNA，操作參照說明書進行。qRT-PCR反應在實時定量PCR檢測系統（EBI，7900）上完成。10μL反應體系為：5μL SYBR Premix、4μL DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物。程序為：95°C 3 min，（95°C 20 s、60°C 20 s、72°C 20 s+讀板）40個循環，（55°C升溫到95°C，每0.5°C讀5 s）溶解曲線。用細菌總16S作為內參進行樣品間的校正，結果用2-ΔΔCt方法進行計算，檢測突變菌株中FGF19的表達。結果顯示，在無氧條件下EcN FGF19-01菌株顯著高表達FGF19 mRNA。
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