DAPI熒光染色計數(shù)法：不同保藏方式時間對海洋微型底棲生物計數(shù)結(jié)果的影響——結(jié)果、結(jié)論
2結(jié)果
2.1站位基本情況
實驗中5個站位(3205、3403、4018、3400-8、3800-1)的環(huán)境因子見表1。
表1五個站位3205、3403、4018、3400-8、3800-1的環(huán)境因子
圖2 DAPI染色后的細(xì)菌(2-1)、硅藻(2-2,2-3)、鞭毛蟲(2-4～2-7)及藍(lán)細(xì)菌(2-8)
2.2保藏方式實驗
利用DAPI染色,對三站位(3205、3403、4018)0～2 cm分層的冷凍、冷藏樣品進行分析。熒光鏡檢觀察到細(xì)菌及各種原生生物的形態(tài)如圖2所示,細(xì)菌大小約為1～2μm,常見為球菌、桿菌、弧形菌;硅藻種類多樣,有圓篩藻、曲舟藻、直鏈藻等,常見10μm大小的直鏈藻;鞭毛蟲形態(tài)多種多樣,有球形,橢球形等,個體大小差異也較大;藍(lán)細(xì)菌多為2個或4個一組存在。
圖3示3205、3403、4018站冷凍、冷藏兩種保藏方式下各類群的豐度。三個站位冷凍樣品中細(xì)菌平均豐度為8.69×108±2.92×108個/mL,較冷藏樣品低25%(平均1.16×109±0.31×109個/mL),2～5μm的鞭毛蟲平均豐度為4.00×106±0.97×106個/mL,較冷藏樣品低25%(平均5.39×106±1.92×106個/mL),5～10μm的鞭毛蟲平均豐度為5.07×105±3.06×105個/mL,較冷藏樣品低23%(平均6.61×105±3.06×105個/mL),＞10μm的鞭毛蟲平均豐度為4.50×104±4.82×104個/mL,較冷藏樣品低79%(平均2.18×105±1.38×105個/mL),硅藻平均豐度為8.35×104±7.71×104個/mL,較冷藏樣品低13%(平均9.63×104±13.9×104個/mL),藍(lán)細(xì)菌平均豐度為2.56×106±0.75×106個/mL,較冷藏樣品高9%(平均2.35×106±0.86×106個/mL)。沉積物中細(xì)菌在豐度(108～109)上占絕對優(yōu)勢(冷藏冷凍樣品98.84%～99.35%),冷藏保存下4018站的細(xì)菌豐度最高;其次是自養(yǎng)小鞭毛蟲(豐度占0.32%～0.57%)、藍(lán)細(xì)菌(豐度占0.12%～0.40%)、異養(yǎng)小鞭毛蟲(豐度占0.02%～0.25%),硅藻豐度所占比例最小(0～0.02%)。三個站位沉積物樣品中相同粒級的自養(yǎng)小鞭毛蟲的豐度均高于異養(yǎng)小鞭毛蟲。自養(yǎng)小鞭毛蟲豐度4018站最高,其次是3403站、3205站。按鞭毛蟲大小看,2～5μm鞭毛蟲的豐度最高,5～10μm鞭毛蟲豐度次之,＞10μm鞭毛蟲豐度最小。
T-test檢驗結(jié)果表明,冷凍、冷藏兩種保藏方式下,3205站和3403站的各測試對象：細(xì)菌、硅藻、藍(lán)細(xì)菌、自養(yǎng)小鞭毛蟲、異養(yǎng)小鞭毛蟲均無差異;4018站的細(xì)菌、硅藻、藍(lán)細(xì)菌、異養(yǎng)小鞭毛蟲及PNF(＞10μm)均無差異,而PNF(2～5μm)、PNF(5～10μm)存在顯著差異(P＜0.05),PNF(2～5μm)冷藏樣品豐度顯著高于冷凍樣品92.1%,PNF(5～10μm)冷藏樣品豐度顯著高于冷凍樣品89.5%(表2)。
圖3冷凍及冷藏兩種保藏方式下3個站位(3205、3403、4018)的細(xì)菌(a)、硅藻(b)、藍(lán)細(xì)菌(c)、自養(yǎng)小鞭毛蟲(d)和異養(yǎng)小鞭毛蟲(e)的豐度
2.3保藏時間實驗
為研究不同保藏時間對細(xì)菌及各原生生物類群定量計數(shù)的影響,對來自黃海的兩個站位(3400-8及3800-1)0～2 cm及2～5 cm分層的樣品經(jīng)保存1個月和4個月后的對比分析見表3。兩個站位的各類群中,細(xì)菌豐度均超過99%,自養(yǎng)小鞭毛蟲占0.42%,異養(yǎng)小鞭毛蟲、藍(lán)細(xì)菌,硅藻所占比例最小。在保存1個月和4個月后各類群所占的百分比基本保持穩(wěn)定。統(tǒng)計分析表明,不同保存時間下,3400-8及3800-1站的兩個分層的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm)、HNF(＞10μm)和硅藻均無差異。3400-8站兩個分層的HNF(2～5μm)均有顯著差異,保存4個月后鏡檢均未檢獲到;而PNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)均無差異。3800-1站0～2 cm分層的PNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)均有顯著差異,保存4個月后PNF(2～5μm)的豐度比1個月時減少了47.4%,HNF(5～10μm)未檢獲到;2～5 cm分層的PNF(2～5μm)、HNF(2～5μm)均有顯著差異,保存4個月后PNF(2～5μm)豐度比1個月時減少了59.6%,HNF(2～5μm)未檢獲到(表3和表4)。
表2不同保藏方式下3205、3403、4018站位的0~2cm分層細(xì)菌,藍(lán)細(xì)菌及原生生物的T-Test檢驗
3討論
3.1保藏方式對定量的影響
Porter等報道福爾馬林固定后的浮游樣品經(jīng)DAPI染色封片后,4℃保存24周,細(xì)菌計數(shù)結(jié)果無差異。Hyun等研究發(fā)現(xiàn)浮游樣品采集后經(jīng)福爾馬林固定,一部分存于樣品瓶中,一部分現(xiàn)場染色封片,均冷凍保存90天。結(jié)果顯示存于樣品瓶后的細(xì)菌數(shù)量為原來的95%,而封片中細(xì)菌數(shù)量為原來的80%,且反復(fù)凍融可造成細(xì)菌數(shù)量損失。但有關(guān)底棲樣品保藏后對實驗結(jié)果的影響研究極少。本研究三個站位中,對于細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、硅藻、三個粒級的異養(yǎng)小鞭毛蟲以及大于10μm的自養(yǎng)小鞭毛蟲,冷凍、冷藏兩種保藏方式無差異;而對于2～5μm與5～10μm的自養(yǎng)小鞭毛蟲來說,在一個站位呈現(xiàn)差異顯著,冷藏獲得的豐度高于冷凍保藏。原因可能在于冷凍樣品的解凍過程對細(xì)胞尤其是較大個體的細(xì)胞造成破碎,解凍對于細(xì)胞壁較為堅實的細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌的影響較小,而對于細(xì)胞壁不太堅實的鞭毛蟲則影響較大。因此,對沉積物樣品短期內(nèi)宜采用避光冷藏保存。此外,沉積物類型的不同,也會對定量計數(shù)造成影響：例如,含砂量較多的樣品過濾到黑膜上后,可造成細(xì)胞分布不均或鏡檢時焦距不同而影響計數(shù),而含泥較多則會遮掩部分細(xì)菌及小的原生生物。
表3兩站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分層樣品在保存1個月和4個月后的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌及原生生物的豐度
表4兩站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分層在保存1個月和4個月后的細(xì)菌及原生生物的T-Test檢驗結(jié)果
3.2樣品保存時間對定量的影響
在樣品保存時間對底棲生物定量分析的影響方面,迄今尚無研究報道。Daley等、Sherr等及Kepner等發(fā)現(xiàn)經(jīng)福爾馬林固定的浮游樣品于5℃下避光保存1～2周后,對細(xì)菌的計數(shù)結(jié)果無差異。Turley曾報道經(jīng)戊二醛固定后的浮游樣品常溫避光保藏,前40天內(nèi)細(xì)胞數(shù)量平均減少39%,并證實無論以何種固定液(戊二醛或甲醛)、樣品瓶(無色或棕色瓶)或染色劑(AO或DAPI)處理,均會造成細(xì)胞數(shù)量的低估。本研究表明樣品隨著保存時間的延長(保藏1個月和4個月),對其定量計數(shù)依不同研究對象而有程度不同的影響：對于細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm)、HNF(＞10μm)、硅藻保存4個月后計數(shù)無影響;而對于PNF(2～5μm)、HNF(2～5μm)、HNF(5～10μm)的影響不同,例如樣品保存4個月后,在3800-1站0～2 cm分層的PNF(2～5μm)豐度比1個月時減少了47.4%,2～5 cm分層的豐度減少了59.6%,而且統(tǒng)計分析存在差異的HNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)在4個月后豐度降為0。可見樣品保藏時間對異養(yǎng)小鞭毛蟲的影響比自養(yǎng)小鞭毛蟲的影響大。總體上,樣品保藏4個月對細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、硅藻均無影響,但對鞭毛蟲有一定的影響,因此建議對鞭毛蟲樣品在采集后宜盡快分析。
4結(jié)語
冷凍和冷藏兩種保藏方式對于細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌和硅藻的影響未呈現(xiàn)明顯差異,但對于自養(yǎng)小鞭毛蟲則冷藏優(yōu)于冷凍方式,故建議短期內(nèi)對沉積物樣品采取避光冷藏保存,并在采集后盡快完成樣品的定量分析。
致謝：本研究樣品源于“中國科學(xué)院海洋研究所2007年度黃海冷水團調(diào)查航次”。杜永芬、代仁海、詹子鋒協(xié)助采樣,李承春協(xié)助部分樣品處理,在此一并致謝。
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