攜帶抗生素耐藥基因沙門菌P1噬菌體-質(zhì)粒效價、形態(tài)、一步生長曲線及最適溫度（一）
摘要
P1噬菌體-質(zhì)粒作為腸桿菌科細(xì)菌抗生素耐藥基因的載體受到人們的關(guān)注，本研究旨在探究攜帶抗生素耐藥基因的P1噬菌體-質(zhì)粒是否具有誘導(dǎo)和進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)特性問題。對沙門菌中攜帶耐第三代頭孢菌素類耐藥基因blaCTX-M-27的P1噬菌體-質(zhì)粒(命名為P1-CTX)的生物學(xué)特性進行研究，包括噬菌體效價、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線、溫度和酸堿穩(wěn)定性等。結(jié)果顯示，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒可誘導(dǎo)產(chǎn)生有裂解能力的完整噬菌體，效價為106 PFU·mL-1，最佳感染復(fù)數(shù)為0.01；P1-CTX噬菌體在低于50℃環(huán)境下活力較好，耐強堿而不耐強酸。可感染沙門菌和大腸埃希菌，且在宿主菌中不產(chǎn)生適應(yīng)代價，穩(wěn)定性較好。綜上表明，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒具有正常的噬菌體生物學(xué)特性，可攜帶耐藥基因通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式水平傳播，且穩(wěn)定性好。
近年來，由于耐藥基因在世界各地細(xì)菌間爆炸性傳播，耐藥病原體對臨床細(xì)菌性疾病的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。溶原性噬菌體作為細(xì)菌基因組的一部分存在于宿主細(xì)菌中，占其基因組的20%，噬菌體誘導(dǎo)后可產(chǎn)生大量噬菌體粒子，并攜帶宿主基因進行高頻基因轉(zhuǎn)移，它們在調(diào)節(jié)細(xì)菌種群和介導(dǎo)水平基因轉(zhuǎn)移中起到了核心作用。P1噬菌體屬于溫和廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，是分子生物學(xué)的重要工具。與大多數(shù)已知的存在于細(xì)菌染色體中的溶原性噬菌體不同，P1噬菌體以環(huán)形質(zhì)粒的形式游離存在于細(xì)菌宿主中，且近期的研究顯示，P1噬菌體作為腸桿菌耐藥基因的載體，或可融合部分質(zhì)粒片段，又稱為P1噬菌體-質(zhì)粒(phage-plasmids，PPs)。有研究報道，大腸埃希菌中P1噬菌體-質(zhì)粒攜帶mcr-1、blaSHV-2、blaCTX-M-55、blaTEM-1b或blaCTX-M-15等耐藥基因以質(zhì)粒形式存在但失去噬菌體活性無法進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)。本課題組前期從屠宰場豬肉分離的沙門菌中，首次發(fā)現(xiàn)攜帶Tn1721-blaCTX-M-27轉(zhuǎn)座子的P1噬菌體-質(zhì)粒介導(dǎo)沙門菌對三代頭孢菌素類抗生素高水平耐藥。此外，最近的研究也報道了肉源沙門菌中相同P1噬菌體-質(zhì)粒。但其是否還具備噬菌體活性并通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的形式進一步傳播耐藥基因尚不清楚。且P1噬菌體-質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中從沉默的質(zhì)粒狀態(tài)到噬菌體粒子形成是一個多步驟的過程，而僅從噬菌體基因組角度分析，很難判定其能否具有產(chǎn)生噬菌體粒子的能力。因此，本研究主要對攜帶Tn1721-blaCTX-M-27的P1噬菌體-質(zhì)粒(命名為P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒)進行誘導(dǎo)，檢測其噬菌體效價，研究P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒形態(tài)、最佳感染復(fù)數(shù)、穩(wěn)定性以及對宿主的影響等方面，旨在評估攜帶耐藥基因溶源噬菌體P1在腸桿菌間傳播耐藥基因的可能，為噬菌體促進細(xì)菌間抗生素耐藥基因擴散的重大影響提供理論支持。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株來源
P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒宿主沙門菌J46以及P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)及裂解受體菌為實驗室前期分離保存。
1.1.2主要試劑
LB固體瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂，廣州環(huán)凱微生物有限公司產(chǎn)品；2×DNA PCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000、6×Loading Buffer，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。
1.1.3主要儀器
DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海申賢恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品；超凈工作臺為蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR擴增儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；Talos F200S型場發(fā)射透射電子顯微鏡為美國FEI公司產(chǎn)品。
1.2方法
1.2.1 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒效價測定
取OD600=0.5、1.0、1.5的沙門菌J46，加入絲裂霉素C(mitomycin C，MitC)至終濃度為2μg·mL－1，分別在26℃、32℃、37℃、42℃振蕩培養(yǎng)，取1、2、4、6、20 h誘導(dǎo)液，13 000 r·min-1離心5 min，0.22μm孔徑過濾器過濾上清回收含噬菌體濾液。
OD600=0.5受體菌沙門菌BYC4與噬菌體1∶1充分混勻，使噬菌體與受體菌表面充分吸附。雙層瓊脂法計算噬菌體數(shù)量。每組試驗重復(fù)3次。噬菌體效價=平均值×10×稀釋倍數(shù)。
1.2.2 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒透射電鏡觀察形態(tài)
將噬菌體懸浮液滴到膜上，將銅網(wǎng)正面向上放入到噬菌體懸浮液中，靜置15 min后，取出銅網(wǎng)。醋酸雙氧鈾(1%，pH=7)印跡并負(fù)染。將已準(zhǔn)備好的樣品置于60 kV條件下用場發(fā)射透射電子顯微鏡進行檢測。
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